Bradford 法是一種比色法（依靠顏色變化）蛋白質定量方法。該方法的核心是 Coomassie 亮藍 G-250 染料。這種染料在未結合狀態(tài)下呈紅褐色，在 465 nm波長處吸收光。然而，當它主要通過精氨酸和賴氨酸殘基與蛋白質結合時，染料的顏色會變?yōu)樗{色，最大吸光度也會變?yōu)?595 nm。這種顏色和吸光度的變化與蛋白質濃度成正比，可用于定量。

需要 Bradford 法的工作流程

蛋白質純化

在每個純化步驟后，確定純化蛋白的濃度對于評估產量和純度至關重要。Bradford法提供了一種快速可靠的蛋白質定量方法，幫助研究人員判斷哪些組分需要合并，并有助于評估純化過程的效率和成功率。

細胞裂解物制備

在將裂解液用于下游應用之前，了解其蛋白質濃度至關重要。這可以確保在不同樣品中使用等量的蛋白質，從而得到一致且可比較的結果。Bradford法通常用于確定這些裂解液中的總蛋白含量。

SDS-PAGE 樣品制備

為了獲得準確的結果，SDS-PAGE 凝膠中的每個孔都必須含有等量的蛋白質。這可確保在比較各泳道的條帶時，觀察到的任何差異都是由于實驗條件而非負載量不均造成的。Bradford法可用于調整樣品的蛋白質濃度，使每個孔中的蛋白質含量相等。

Bradford 檢測方法

標準曲線法

這是最常見的方法，包括使用已知濃度的標準蛋白質（通常是牛血清白蛋白 (BSA) 或γ 球蛋白）繪制校準曲線。

1. 準備一系列標準蛋白質稀釋液，以覆蓋樣品中蛋白質濃度的預期范圍。
2. 在每個標準稀釋液中加入Bradford試劑并孵育一小段時間（通常為 5-10 分鐘）。
3. 使用分光光度計在 595 nm波長處測量每個標準品的吸光度。
4. 將吸光度值與已知蛋白質濃度相對照，生成標準曲線。
5. 測量未知樣品的吸光度，并根據(jù)標準曲線確定其蛋白質濃度。

單點法

標準曲線法的快速替代方法。它是利用單一已知濃度的標準蛋白質來估計未知樣品的蛋白質濃度。

1. 制備濃度在樣品預期范圍內的單一標準蛋白質。
2. 在標準樣品和未知樣品中加入Bradford試劑。
3. 測量標準樣品和未知樣品的吸光度。
4. 利用吸光度與已知標準品濃度的比值計算未知樣品的蛋白質濃度。

微孔板法

該方法將 Bradford 法改良為使用微孔板進行高通量分析，可同時測定多個樣品。

1. 將標準樣品和未知樣品移入微孔板的孔中。
2. 在每個孔中加入 Bradford 試劑。
3. 培養(yǎng)所需時間。
4. 使用微孔板閱讀器在 595 nm波長處測量各孔的吸光度。
5. 如果在微孔板格式中使用標準曲線法，則將標準品的吸光度值與其已知濃度相對照，生成校準曲線。利用此曲線確定未知樣品的蛋白質濃度。

與手動移液相比，自動化 Bradford 法的優(yōu)勢：

• 一致性和可重復性： 自動化可減少人為誤差，使結果更加一致。
• 高通量： 自動化系統(tǒng)可同時處理多個樣本，提高了效率。
• 降低污染風險： 自動化最大程度地降低了樣本間交叉污染的幾率。
• 數(shù)據(jù)記錄： 自動化系統(tǒng)通常配有記錄數(shù)據(jù)的軟件，從而更容易跟蹤和分析結果。