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免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

一種用于從細(xì)胞裂解物等復(fù)雜混合物中選擇性分離和濃縮特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組的技術(shù)。免疫沉淀的主要目的是研究蛋白質(zhì)之間的相互作用、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)功能。通過提取目標(biāo)蛋白質(zhì)及其相互作用的伙伴,研究人員可以確定這些相互作用的特征。

需要免疫沉淀的工作流程

  • 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究: 鑒定和驗(yàn)證與相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。
  • 翻譯后修飾分析: 富集具有特定修飾(如磷酸化或泛素化)的蛋白質(zhì)。
  • 功能測(cè)定: 在受控環(huán)境中研究蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的活性。

免疫沉淀的最佳方法


免疫沉淀(Classic Immunoprecipitation, Classic IP)

從復(fù)雜混合物中分離出特定蛋白質(zhì),用于研究其特性、翻譯后修飾或進(jìn)一步分析。

步驟:
  1. 使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞以釋放蛋白質(zhì)。
  2. 將針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)定制的特異性抗體附著在珠子(瓊脂糖或磁性)上。
  3. 細(xì)胞裂解液與抗體-磁珠復(fù)合物孵育,使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。
  4. 使用洗滌緩沖液洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
  5. 然后使用洗脫緩沖液將目標(biāo)蛋白質(zhì)從珠子上洗脫下來。
  6. 使用離心機(jī)或磁力架從裂解液中分離出與抗體珠結(jié)合的蛋白質(zhì)。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)

從復(fù)雜的生物樣本中分離出主要蛋白質(zhì)及其潛在的相互作用伙伴,從而研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。

操作步驟:
  1. 細(xì)胞裂解以釋放蛋白質(zhì)。
  2. 將針對(duì)原生蛋白定制的特異性抗體附著在珠子上。
  3. 細(xì)胞裂解液與抗體-珠子復(fù)合物一起孵育。
  4. 在此步驟中,與原生蛋白相互作用的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生共沉淀。
  5. 非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)會(huì)被洗去。
  6. 原生蛋白及其相互作用蛋白被洗脫。
  7. 使用離心機(jī)或磁力架分離與抗體珠結(jié)合的蛋白質(zhì)。

串聯(lián)親和純化 (Tandem Affinity Purification, TAP)

實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的高純度純化,尤其適用于研究低豐度或瞬時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

步驟:
  1. 對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因改造,使其包含雙標(biāo)記系統(tǒng)。
  2. 對(duì)表達(dá)這種修飾蛋白的細(xì)胞進(jìn)行裂解。
  3. 首先將裂解液與與第一個(gè)標(biāo)簽結(jié)合的珠子孵育,分離出蛋白質(zhì)。
  4. 使用特定的蛋白酶將第一個(gè)標(biāo)簽裂解掉。
  5. 使用與第二個(gè)標(biāo)簽結(jié)合的珠子進(jìn)行第二輪純化。
  6. 經(jīng)過這一步驟后,蛋白質(zhì)復(fù)合物被洗脫出來,純度很高。
  7. 使用離心機(jī)分離與珠子結(jié)合的蛋白質(zhì)。

為什么免疫沉淀很困難:

  • 特異性問題: 蛋白質(zhì)與珠子或抗體的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致假陽性。
  • 靈敏度問題: 低豐度蛋白質(zhì)可能無法被有效吸附,從而導(dǎo)致假陰性。
  • 維持蛋白質(zhì)相互作用: 有些蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用是瞬時(shí)或微弱的,因此在 IP 過程中捕獲并維持這種作用具有挑戰(zhàn)性。

免疫沉淀從未如此簡(jiǎn)單

OT-2是一款臺(tái)式液體處理器,其設(shè)計(jì)足夠方便且靈活,可以自動(dòng)化許多常見的應(yīng)用。

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如何實(shí)現(xiàn)免疫沉淀過程的自動(dòng)化:

  • 液體處理工作站: 這些工作站可自動(dòng)添加和移除溶液,確保移液的一致性和精確性。
  • 磁珠分離: 自動(dòng)化平臺(tái)可處理磁珠分離,減少操作時(shí)間并提高一致性。
  • 整合系統(tǒng): 有些平臺(tái)將樣品制備、IP 和下游分析(如質(zhì)譜)整合到一個(gè)工作流程中。

免疫沉淀自動(dòng)化比手動(dòng)移液的優(yōu)勢(shì):

  • 一致性和可重復(fù)性: 自動(dòng)化減少了人為錯(cuò)誤和可變性。
  • 通量: 自動(dòng)化系統(tǒng)可同時(shí)處理多個(gè)樣品,提高效率。
  • 降低污染風(fēng)險(xiǎn):盡量減少人工操作,降低樣品污染的幾率。
  • 優(yōu)化方案: 自動(dòng)化系統(tǒng)通常帶有優(yōu)化的操作程序,可確保獲得最佳結(jié)果。

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