作者：

Boren ???Lin,PhD,Shadie ????Nimri?Sean ???Arabian?Kinnari ????Watson,PhDI 1Opentrons ??Labworks,Inc.,?Biotage???LLC.

摘要
本次應用針對使用 BiotagePhyTip° 柱在 Opentrons OT-2 自動 化移液工作站上進行雙流層析的自動化進行了應用開發(fā)。測試了兩 種類型的 PhyTip 柱：用于 His 標記蛋白提取的 Ni-IMAC 柱和用于 人源 IgG 純化的蛋白 A 系列柱，包括蛋白 A、ProPlus 和ProPlus LX。結果表明，OT-2 和 PhyTip 柱結合使用96孔板進行小規(guī)模蛋白樣品處理，可獲得優(yōu)異的樣品產量、濃度。

關鍵發(fā)現(xiàn)
在使用PhyTip Ni-IMAC柱進行純化時， OT-2 能夠在保持活性 的同時對His標記的GAPDH 蛋白進行純化。同時，在使用蛋白 A、ProPlus 和 ProPlus LX PhyTip 柱進行人源 IgG 純化時，OT-2 也展現(xiàn)了出色的純化能力。使用蛋白A、ProPlus 和ProPlus LX PhyTip 柱，可以在OT-2上全自動運行多步驟純化，例如免疫沉淀。
● 蛋白質分析驗證了提取蛋白為目標蛋白，成品是符合預期的。
● 在實驗設置中，該應用協(xié)議可以處理最多96個樣品，且僅需占用很少的人工操作時間。

簡介
近年來，由于蛋白質表征分析和功能測定的發(fā)展迅速，行業(yè)對蛋白 質分析的需求與日俱增。因此，許多可用于通過親和層析擴大蛋白 質分離通量的技術應運而生，而親和層析已成為早期藥物發(fā)現(xiàn)中的重要工具。然而，市面上適用于小規(guī)模蛋白純化的設備卻很少。并且由于研究人員缺乏編程和自動化專業(yè)知識，可能會導致在建立 這些流程時產生很多不必要的開銷，在優(yōu)化工作流程時，會帶來額外的成本負擔。

PhyTip 柱是基于移液器吸頭進行工作的色譜柱，通過移動相(例 如樣品溶液)在固定相(即填充在尖端中的樹脂)上的雙向流動來 將目標生物分子與非目標分子分離，這個過程被稱為雙流層析。純 化后的樣品可以以小體積洗脫，從而得到高濃度的樣品。雙流層析 是一種溫和的純化過程，產生具有高生物活性的蛋白質。這些 PhyTip 柱利用了蛋白 A 進行抗體的純化或富集。蛋白 A 是一種分 子量為49 kDa 的蛋白，對大多數 IgG 的 Fc 區(qū)域具有較高的親和力。

ProPlus (MabSelectTM SuReTm,Cytiva)和ProPlus LX (MabSelect SuRe,Cytiva) 是使用經過改良的蛋白 A 制備吸頭。蛋白 A 具有更強的結合目標 IgG 的能力，通常被用于抗體的純化和富集。

金屬親和層析(IMAC) 是另一種常見的方法，用于從粗樣品中純 化或富集目標蛋白。這種方法利用金屬離子提取具有基因工程標簽 的重組蛋白，它們通常是能夠螯合金屬離子的肽序列。PhyTip柱與 鎳離子(Ni)-IMAC 親和樹脂結合，通過 Ni2+ 和組氨酸堿基之間的強親和力，高效純化多組氨酸 (His) 標記的蛋白。

OT-2 是一個對生物學家非常友好的自動化平臺。PhyTip 柱使用與 OT-2 的單通道和8通道移液器兼容的吸頭，從而實現(xiàn)了在 OT-2 上 執(zhí)行全自動蛋白純化。本次研究對 PhyTip 柱在 OT-2 上的性能表現(xiàn)進行評估，并展示了該平臺可適配多種應用的能力。通過PhyTip 柱與 OT-2 平臺結合使用，研究人員能夠實現(xiàn)自動化運 行蛋白質純化，提高操作的便捷性和一致性。這為各種不同的應用提供了更適用的解決方案，并為高通量的純化和富集提供了支持。

材料和方法
在 Opentrons OT-2 平臺上使用PhyTip 色譜柱進行蛋白質純化工作流程概述
該過程的第一部分是“試劑孔板準備”,用于準備 PhyTip 柱架和試 劑孔板。其中包括平衡緩沖液孔板、兩個用于不同洗滌緩沖液的孔 板以及一個洗脫緩沖液孔板。該過程的第二部分是“蛋白質純 化”,通過使用 PhyTip 柱進行雙流層析來捕獲和富集目標蛋白 質。這是通過使樣品或緩沖液通過柱體內部的樹脂(即上下移液) 而實現(xiàn)的。設置環(huán)節(jié)包括循環(huán)次數、流速和緩沖液體積，這些設置根據具體應用進行調整(表1)。

表1:?PhyTip?柱在?Opentrons?OT-2?上測試的設置和運行時間

試劑孔板制備和蛋白質純化方案的 OT-2 平臺布局示意圖(圖1)
在這項研究中測試的 PhyTip 柱型號包括：
● Pro A 20μL PTX-93-20-01
● ProPlus 20 μL PTX-93-20-07
● ProPlus LX 20 μL PTX-93-20-26
● Ni-IMAC 20 μL PTX-93-20-03

蛋白質純化流程
1.取出 PhyTip 柱
2.平衡化
3.捕獲目標蛋白質
4.洗滌(第一次)
5.洗滌(第二次)
6.洗脫

實驗結果
分離 His 標記的 GAPDH, 同時保留活性通過 SDS-PAGE 和蛋白定量分析，我們得出了在 PBS 中提取的 帶有 His 標簽的 GAPDH 樣品具有理想產量和一致性的結論(平均產量為79%,變異系數為3%) (圖2上部)。

從細菌裂解液中分離 His 標記的 GAPDH生產重組蛋白的常見方法是用質粒轉化大腸桿菌
OT-2 平臺上使用 PhyTip 柱沒有破壞酶活性，這是通過 GAPDH活性測定得出的結果(圖2中部)。此外，結果還表明，在兩種不同蛋白質的樣品中均能夠成功地將 His 標記的 GAPDH 與非目標蛋白的BSA 分離開來(圖2下部)。

原文地址：在OT-2上使用Biotage雙流色譜PhyTip柱進行自動化蛋白質純化