摘要
隨著生命科學(xué)屆對PCR的需求正在增加。在本應(yīng)用說明中，我們展示了 Opentrons PCR 工作站與市面主流的外置第三方熱循環(huán)儀相 比，能夠生成預(yù)期的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基對長度。結(jié)果顯示，無論是嵌套PCR還是多重PCR, 都能產(chǎn)生預(yù)期的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基 對長度。

簡介
由于樣品制備過程中可能存在污染、技術(shù)錯(cuò)誤和時(shí)間限制，復(fù)雜方案(例如巢式 PCR 和多重 PCR) 的效率和準(zhǔn)確性難以保障。多重 PCR 實(shí)驗(yàn)用于 GMO (轉(zhuǎn)基因生物)檢測、法醫(yī)學(xué)、食品分析、突變和多態(tài)性檢測、基因缺失分析、模板定量、連鎖分析以及更多應(yīng) 用。這些多重反應(yīng)非常高效，可在孔槽中產(chǎn)生兩個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增子的產(chǎn)物。

巢式 PCR 是另一種高度特異性的技術(shù)，可用作有用的診斷工具，用于識別生物樣品中的病原體，例如動脈粥樣硬化斑塊中的牙周病 原體、轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞以及結(jié)核分枝桿菌和馬爾尼菲青霉等病毒病原體與僅需要一個(gè)擴(kuò)增步驟的標(biāo)準(zhǔn)PCR 不同，巢式 PCR 具有兩 步擴(kuò)增過程。第一個(gè) PCR 擴(kuò)增步驟中生成的 PCR 擴(kuò)增子用作第二個(gè)擴(kuò)增步驟的模板。這些復(fù)合 PCR 實(shí)驗(yàn)可能會因最終產(chǎn)品的不同 而變得繁瑣和耗時(shí)。Opentrons PCR 工作站可以自動化實(shí)現(xiàn) PCR 實(shí)驗(yàn)，只需要進(jìn)行非常少量的手動準(zhǔn)備工作，就可以產(chǎn)出穩(wěn)定的一 致性結(jié)果。

材料和方法

多重 PCR 實(shí)驗(yàn)步驟
使用從銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌分離的基因組 DNA 進(jìn)行了多重 PCR 實(shí)驗(yàn)。根據(jù)先前的研究，設(shè)計(jì)了針對銅綠假單胞菌 (lasl、lasR、gyrB) 和金黃色葡萄球菌(16s rRNA、clfA、mecA、Eubacterial 16S rRNA)多個(gè)位點(diǎn)區(qū)域特異性的正向和反向
引物。每個(gè)孔預(yù)期產(chǎn)物的大小分別為600、700和222bp。 在 Opentrons OT-2 的平臺上，在0.1 ml 96 孔全裙邊 NEST 板上準(zhǔn)備 了20 μL的多重 PCR反應(yīng)混合物，并使用設(shè)備上的熱循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時(shí)，為了對比分析， 我們也用手動準(zhǔn)備了相同的實(shí)驗(yàn)，并在第三方手動熱循環(huán)儀上運(yùn)行。

巢式 PCR 實(shí)驗(yàn)步驟
巢式 PCR 是用于鑒定從 lambda 噬菌體分離的生物樣品中的病原體的方法。根據(jù)先前的研究，針對銅綠假單胞菌 (lasl、lasR、 gyrB) 和金黃色葡萄球菌(16S rRNA、clfA、mecA、Eubacterial 16S rRNA) 設(shè)計(jì)了特異性的多個(gè)位點(diǎn)區(qū)域的正向和反向引物。 PCR組分被提供給OT-2 平臺，并轉(zhuǎn)移到0.1 ml96 孔 NEST板中。在混合和 Opentrons 熱循環(huán)模塊自動密封之前，最后加入 DNA 模板。對于第二個(gè)擴(kuò)增步驟，使用0.1 ml 的 NEST 孔板重復(fù)此過程，并將其密封后放置在第三方熱循環(huán)儀上。第一次擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn) 物被用作陽性對照。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。所有實(shí)驗(yàn)都使用Qubit BR定量，并計(jì)算變異系數(shù)以評估擴(kuò)增的一致性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
使用Opentrons 熱循環(huán)模塊在OT-2上進(jìn)行自動化多重PCR實(shí)驗(yàn)，運(yùn)行結(jié)果顯與第三方熱循環(huán)儀相當(dāng)。

多重 PCR的實(shí)驗(yàn)布局采用了 Kim 等人在2018年的研究中的方法。樣品孔位標(biāo)記為綠色，陰性對照標(biāo)記為藍(lán)色(見圖1)。

為了評估自動化多重 PCR 的高靈敏度和特異性，在凝膠上進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測。與第三方熱循環(huán)儀生成的PCR 產(chǎn)物相比(圖2B), OT-2熱循環(huán)儀上生成的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物不僅顯示出更清晰和明顯的條帶，而且長度符合預(yù)期 (lasl為600bp,lasR 為700bp,gyrB 為222bp) ( 圖 2A)。
為了進(jìn)一步證明 OT-2 的效率，使用針對金黃色葡萄球菌(16s rRNA 、clfA 、mecA 、Eubacterial 16s rRNA) 的特異性引物進(jìn)行 了自動化多重 PCR。預(yù)期的堿基對長度分別為791bp、638bp、499bp 和371bp, 并在瓊脂糖凝膠上檢測(圖2C) 。 同時(shí)，使 用相同的PCR組分進(jìn)行了手動多重 PCR協(xié)議，使用第三方熱循環(huán)儀進(jìn)行操作(圖2)。在 OT-2上自動化和手動進(jìn)行的多重 PCR都 顯示出了類似的擴(kuò)增效果(圖2A、2B)。

在每個(gè)孔位上測試的銅綠假單胞菌基因組DNA 中擴(kuò)增了預(yù)期長度為600、700和222 bp 的lasl、lasR和gyrB目標(biāo)。
A)1-8 道顯示了在OT-2 上自動加樣和熱循環(huán)后的產(chǎn)物。
B)1-8 道顯示了在第三方熱循環(huán)儀上手動加樣后的產(chǎn)物。在每個(gè)孔位上測試的金黃色葡萄球菌基因組DNA 中擴(kuò)增了預(yù)期長度為 791、638、499和371 bp 的16S rRNA、clfA、mecA和真菌的16S rRNA目標(biāo)。
C)1-8 道顯示了在OT-2 上自動加樣和熱循環(huán)后的產(chǎn)物。
D)1-8 道顯示了在第三方熱循環(huán)儀上手動加樣后的產(chǎn)物。

為了驗(yàn)證在OT-2 和第三方熱循環(huán)儀上生成的 PCR 的精確性，分析了變異系數(shù) (CV%), 結(jié)果顯示在多重 PCR 和 巢 式 PCR 實(shí)驗(yàn)中， OT-2 的 CV% 值與第三方熱循環(huán)儀相比相同或較低，表明擴(kuò)增的均勻性更好(見表1)。

表1:在不同模板類型和PCR實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出高度均勻的擴(kuò)增效果。
CV值(變異系數(shù))為經(jīng)過Qubit 定量后計(jì)算得出的結(jié)果，分別顯示了在OT-2 和第三方熱循環(huán)儀上進(jìn)行的每個(gè)實(shí)驗(yàn)的CV值。

在巢式?PCR?的布局中，樣品孔以綠色標(biāo)記，陰性對照孔以藍(lán)色標(biāo)記(圖3)

設(shè)計(jì)了兩組引物，用于檢測 Lambda  模板 DNA 的500 bp 和247 bp 區(qū)域。第一次PCR 運(yùn)行中檢測到了500 bp 區(qū)域，而第二次 PCR 運(yùn)行中檢測到了247bp  區(qū)域。樣品進(jìn)行了三次巢式 PCR 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，然后在 PCR 運(yùn)行結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。

在瓊脂糖凝膠上分析了在?OT-2 ?和第三方熱循環(huán)儀上生成的?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4)。外層擴(kuò)增片段的預(yù)期大小為500 bp, ???內(nèi)層擴(kuò)增片?段為247 bp?。PCR?擴(kuò)增產(chǎn)物顯示出類似的產(chǎn)量和變異系數(shù) (CV%) ???(表1),實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了?OT-2 ?的產(chǎn)出與手工操作和第三方設(shè)備?一致。

結(jié)論

Opentrons  PCR 工作站與第三方手動熱循環(huán)儀對比，在 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度方面表現(xiàn)出精確的擴(kuò)增能力，并且移液精準(zhǔn)度高。此  外，Opentrons PCR 工作站展示了在一個(gè)孔中準(zhǔn)確進(jìn)行多重 PCR 以及巢式 PCR 實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增能力。