摘要
三個圖書館準備工具包-Illumina?DNA準備工具包，KAPA?超級準備工具包和NEBNext?Ultra?II試劑盒-都是通過Opentrons OT-2自動快速和穩(wěn)健地制備下一代測序的高質量文庫。
從lambda和人類基因組DNA中制備了100 ng輸入的文庫。
觀察到庫的類似性能，用OT-2上的三個套件準備的樣本變異性和產量。類似的排序指標，如條形碼平衡和序列比對也觀察到覆蓋范圍。

介紹
DNA文庫的制備是下一步工作的關鍵步驟代測序（NGS）。自動化的DNA文庫制備為構建高產測序文庫提供了一種簡化的方法同時盡量減少實際操作時間。在這里，我們描述海百合DNA制備自動化的效率裝備(伊利，CatNo。20018705)，KAPA超級試劑盒(羅氏?. , CatNo.7962363001)和NEBNext超II試劑盒(新英格蘭生物實驗室?. , CatNo.E7645L)在OT-2機器人液體處理平臺上。

材料和方法
Illumina DNA制備試劑盒、KAPA超級制備試劑盒、NEBNext Ultra II和視中心OT-2平臺概述
擁有專利NGS標記工作流程，利用珠聯(lián)轉座體，這不同于KAPA HyperPrep和NEBNext Ultra II工作流程-DNA末端修復和a尾的解決流程。

對于Illumina DNA準備試劑盒，使用OT-2上的雙索引適配器對DNA進行標記和標記。DNA樣品（n=8,100 ng）量化，歸一化到一個4 nM的庫，匯集到一個多路復用的樣本，然后在一個2x75上運行在Illumina MiSeq上的流式細胞進行基因組測序。工作流程包括生成DNA準備庫Lambda（n=24）和人類基因組DNA樣本（n=8）。

對于HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA制備試劑盒，我們在OT-2上構建了抗體DNA片段（n=8,100 ng）的DNA文庫。使用的條形碼來自KAPA獨特的雙索引適配器，和NEB多重雙索引II為NEBNext索引設置1。樣本被定量、歸一化，并匯集到一個4 nM的文庫中，并在一個帶有2x75的MiSeq上進行測序流路池該工作流程包括為=片段DNA（n=24）和人類基因組DNA（n=8）生成文庫。

測序數(shù)據(jù)由Illumina公司進行解復用
基本空間?根據(jù)適配器的條形碼序列，并與參考基因組對齊。利用Geneious技術對該基因組的覆蓋圖譜進行了分析?主要的2021.2.21. 我們的數(shù)據(jù)顯示了較低的樣本變異性和在OT-2上使用DNA制備試劑盒制備的文庫的可靠一致性。

OT-2工作流協(xié)議的原理圖

對于Illumina的DNA準備試劑盒，DNA和IDT?為了伊利DNA/RNA UD指數(shù)集A。.
在OT-2上進行了標記（圖1）。A
清洗步驟是必要的，以去除殘留的DNA和適配器接下來，使用具有可編程蓋子和塊溫度的OT-2甲板上熱循環(huán)器進行PCR擴增。

對于HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA制備試劑盒，都用NEB片段酶進行片段化。
人類16分鐘，人類20分鐘基因組DNA，然后用AMPure進行清理?XP珠子(貝克曼庫爾特，CatNo。. A63881).對OT-2進行DNA末端修復/A尾跡，然后是AMPure XP珠子清理步驟、條形碼或適配器連接（圖1）。使用的條形碼來自KAPA獨特的雙索引適配器(羅氏，CatNo。08861919702). 對于HyperPrep和NEB多重雙索引引物集1 (NEB，CatNo。E7335L)為NEBNext Ultra II。.

使用甲板上的熱循環(huán)器在OT-2上進行DNA擴增。

工作流布局
Opentrons OT-2平臺的布局包括模塊、實驗室軟件和DNA準備試劑（圖2）。
雖然工作流程包括在OT-2上的自動移液，但需要手動干預，在甲板上的恒溫器和磁塊之間移動樣品板，并在此期間重置移液管尖端架協(xié)議。

圖2：OT-2甲板布局

模塊，實驗室軟件，和DNA準備試劑。這個

標準化的甲板布局與HyperPrep和其他平臺共享

NEB下一個Ultra II。該工作流程在OT-2上自動移液，需要手動干預在甲板上恒溫筆和之間移動樣品板(1)

磁性磁塊(2)，以及在運行過程中重置尖端機架。甲板布局包括1個NEST 12井儲層，1 x 96井鋁塊，1個熱循環(huán)器上的200μl PCR板，溫度模塊上的1個NEST0.1 mL PCR板(3)。模塊包括一個磁性模塊、溫度模塊、熱循環(huán)器模塊，以及P20和P300 8通道移液管。

結果
DNA文庫擴增
使用PicoGreen檢測DNA文庫?在一個量子位?4.用熒光計測定濃度。CV（變異系數(shù)為標準差除以平均值）。所有文庫的最終洗脫體積均為30μL。對于使用Illumina準備的庫
DNAPrep（n=8,100ng）的CV為10.7%（n=24,100 ng）的CV為16.6%（表1A）。為文庫使用HyperPrep制備，CV為（n=8100ng）的13.4%，（n=24100ng）的CV為17.6

. 1B)使用NEBNext Ultra II制備的文庫顯示（=8）的CV為12.1%，（=24）的CV為14.5%
（表1C)。在OT-2上制備的lambda和人類DNA文庫的產量（ng/μl）、CV（%）和片段大?。╞p）的比較見表2。

DNA制備文庫的小基因組測序
多路復用的DNA準備文庫(n=8,100在Illumina上使用2x75流動細胞進行測序MiSeq儀器。第二批DNA準備文庫（n=24,100 ng）在OT-2上的3個單獨的列中進行處理，以解釋一批內的任何柱間可變性。安捷倫?5300年碎片分析儀計算

用DNA制備文庫的片段大小來確定
在OT-2上制備的文庫的可靠均勻性（表3A-3C）。同樣，在OT-2上構建的48 kb基因組的一致測序覆蓋顯示了8倍路DNA制備文庫的一致性
（表4）。

條形碼平衡是準確的DNA準備樣本顯示的平均11.2%–12.31%的伊利米納
DNA Prep，KAPA HyperPrep的10.6%–14.1%，NEBNextUltraII的10.5%–14.6%（圖3）.
比較DNA制備試劑盒的尖端分配和OT-2方案的持續(xù)時間（表5）。

結論
我們驗證了免疫DNA準備，KAPA超準備，和NEBNext Ultra II在OT-2和演示了它在下一代測序的文庫制備中的應用。我們發(fā)現(xiàn)，DNA Prep樣本在復制和化學中表現(xiàn)出低可變性，甚至樣本條形碼平衡，并且高序列比對的覆蓋范圍，表明OT-2可以用來可靠地自動化制備高質量的DNA文庫。

原文地址：使用DNA制備試劑盒自動制備小基因組的文庫