作者
馬修·阿卡納，金納里·沃森博士，莫拉約·阿德伊比博士。

介紹
下一代測序（NGS）的工作流程包括使用市售軟件制備DNA文庫以及經(jīng)濟有效的DNA制備試劑盒。通過使用自動化的OT-2協(xié)議來優(yōu)化這個工作流很有幫助以提高DNA文庫的制備效率。
在這里，我們描述了伊利?DNA的效率。準備工具包(Illumina，CatNo。20018705)在OT-2，機器人液體處理平臺上，自動執(zhí)行標記工作流程。使用OT-2的高性能能力自動化此過程提供了一個快速和健壯的工作流程，生成用于基因組測序的統(tǒng)一DNA準備文庫。

照明?DNA準備試劑盒和外中心OT-2平臺概述
伊利?專利NGS標記工作流程實現(xiàn)了利用珠子進行的珠上標記鏈接的轉(zhuǎn)座體。珠鏈的化學(xué)性質(zhì)轉(zhuǎn)座體對DNA片段化更有效和DNA末端修復(fù)與之前的溶液內(nèi)標記工作流程相比。該DNA片段使用雙索引適配器進行標記，這是一種獨特的條形碼分配每個DNA片段。DNA Prep樣本（n=8）分別為量化，歸一化到一個4nM的庫，匯集到一個單個多路復(fù)（8倍或16倍）樣品，然后在Illumina?MiSeq上的2x75流細胞上進行基因組測序。我們的數(shù)據(jù)顯示了所有數(shù)據(jù)的低可變性，PNA擴增前后測定的DNA制備樣本；條形碼平衡，以及統(tǒng)一和高覆蓋率的測序比對。參考基因組的研究表明，使用OT-2協(xié)議的自動標記為基因組測序提供了一個高質(zhì)量的DNA準備文庫。

OT-2工作流協(xié)議的原理圖
DNA和IDT?對?DNA/RNA UD指數(shù)集A的DNA和IDT?。20027213)在孵育期間一個被稱為標記的過程，在OT-2上，如圖（圖1）所示。進行了標記清洗步驟，以去除殘留的DNA和適配器。下一個的用OT-2方法進行DNA擴增具有可編程蓋和塊溫度的甲板上熱循環(huán)器。

按照OT-2方案，進行后擴增
使用AMPure(貝克曼庫爾特，貓。不a63881)根據(jù)制造商進行檢測推薦DNA Prep樣本被定量，歸一化至4nM(使用NEBNext?文庫定量試劑盒對伊利?文庫定量進行qPCR測定試劑盒，以8倍或16倍的形式匯集成單個樣本，然后在伊利?MiSeq上的2x75流池上運行。根據(jù)伊利?DNA/RNA獨特雙（UD）索引適配器條形碼序列，提取測序數(shù)據(jù)并進行解復(fù)用。與參考基因組和覆蓋圖譜對齊的序列是通過真真品2021.2.2

工作流布局
OT-2平臺的布局包括模塊，實驗室軟件，和伊利米納?DNA準備試劑，如詳見（圖2）。雖然該工作流包括：在OT-2上進行自動移液，人工干預(yù)是需要在甲板上的之間移動樣品板熱循環(huán)筆和磁塊，并在協(xié)議期間重置移液管尖端架。

DNA制備樣本的PCR擴增
采用伊利?DNA制備試劑盒構(gòu)建OT-2上的Lambda DNA文庫（n=8,100 ng）。分別定量前后PCR濃度（ng/uL）5個周期的PCR擴增，和DNA濃度使用Quant-iT?dsDNA高靈敏度檢測試劑盒(熱費雪科學(xué)公司，Cat。No.Q33120)在一個Qubit?上確定變異系數(shù)，即標準差除以整個樣本的平均值。Lambda DNA樣本的PCR前平均濃度為2.92，變異系數(shù)（CV）為10.4%，5個周期后的PCR后濃度平均為28.23，CV為10.7%，見（表1）。這些結(jié)果很簡單，優(yōu)化后的OT-2協(xié)議可以產(chǎn)生一個高質(zhì)量和可靠的NGS DNA準備庫。

DNA制備文庫的小基因組測序
對96個樣本的?DNA制備試劑盒(M)進行標記。用No. 20018705)制備了大腸桿菌非甲基化基因組DNA (Zymogen，Cat。. 不. 樣品（n=16,100ng）

這個工作流在OT-2上都有自動的移液功能，需要手動操作在甲板上移動樣品板(1)和磁性磁塊(2)，以及復(fù)位在運行期間的尖端機架。甲板布局包括1個NEST 12井水庫，1個96井鋁塊，1倍埃彭多夫熱循環(huán)器上的200ul PCR板，和一個1xNEST0.1 mL PCR板上溫度模塊(3)。模塊包括一個磁性模塊、溫度模塊、熱循環(huán)器模塊，以及P20和P300多通道移液管。

兩批，第二批，E。. 大腸桿菌DNA樣本
（n=8,100 ng）在OT-2上的2個單獨的列上進行處理，以解釋列內(nèi)可能出現(xiàn)的可變性。
E. 大腸桿菌DNA（n=16,100 ng）和Lambda DNA (n=8,100ng)被擴增、歸一化，并匯集到一個單一的多路復(fù)用（8倍或16倍）樣本中進行測序。
對三個DNA制備批次的測序結(jié)果為比較確定樣品產(chǎn)量，條形碼
. 平衡和覆蓋率，如（表2）所示，對DNA制備文庫觀察到統(tǒng)一的產(chǎn)量。計算了E的樣本產(chǎn)量。8號試驗室的大腸桿菌含量分別為9.75和3.79
. 16倍；8倍和16倍?適配器條碼的CV值分別為8.77%和6.2%，顯示8倍和16倍樣本的平衡是準確的8倍的平均11.2%-12.31%，相比之下，預(yù)期的為12.5%。對于16-plex，根據(jù)伊利?參考計算的6%的期望值為6.2%。DNA的平均基因組覆蓋率準備了E。大腸桿菌樣本的8倍為150倍，16倍為45倍
. 此外，Lambda 48kb基因組的覆蓋圖譜顯示~為7800倍，這表明對齊的序列reads水平較高（圖3）?？偟膩碚f，這表明在OT-2上構(gòu)建的用于測序的DNA Prep文庫與參考計算相比顯示出一致性（圖4）。

結(jié)論
我們演示了它的高性能和性能。在視中心OT-2上使用伊利umina?DNA準備試劑盒自動標記過程。我們展示了DNA Prep樣本顯示出低變異性，條形碼平衡性，以及序列比對的高覆蓋率。自動化這個全面的NGS工作流在的上OT-2將DNA文庫制備過程中的風(fēng)險降至最低，同時確保基因組的DNA文庫制備質(zhì)量先后順序