應(yīng)用概述
隨著不斷進(jìn)步的技術(shù)推動(dòng)，現(xiàn)代分子生物學(xué)持續(xù)取得萬眾矚目的 突破和發(fā)展，包括更大規(guī)模的研究、更強(qiáng)大的治療方法以及全新 的研究問題。然而，盡管核酸提取這項(xiàng)技術(shù)是分子生物學(xué)得以進(jìn) 步的一項(xiàng)重要且密不可分的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，科研人員仍然在沿用著幾 十年前冗長(zhǎng)而繁瑣的程序進(jìn)行核酸提取。在這樣的困局之下，自 動(dòng)化解決方案應(yīng)運(yùn)而生。現(xiàn)代自動(dòng)化通過引入具備穩(wěn)定性和高效 運(yùn)作優(yōu)勢(shì)的機(jī)器設(shè)備完成標(biāo)準(zhǔn)化流程高效自動(dòng)運(yùn)行，自動(dòng)化核酸 提取將使生物實(shí)驗(yàn)室舊有的工作方式迎來現(xiàn)代化。為了真正意義 上幫助科研人員達(dá)到高效研發(fā)或生產(chǎn)的目的，自動(dòng)化系統(tǒng)需要達(dá) 到甚至超越高技能技術(shù)人員的表現(xiàn)，為下游工作流程提供高質(zhì)量的樣本。

本項(xiàng)研究旨在測(cè)試Opentrons OT-2核酸工作站作為有效自動(dòng)化 磁珠基因提取工具的性能。研究中使用了幾種研究人員和臨床醫(yī) 生常用的常見模板：人類唾液、人類口腔拭子、細(xì)菌培養(yǎng)物和 RNA 病毒。同時(shí)，使用了行業(yè)中常見的主流試劑品牌。通過產(chǎn) 量、CV 值和qPCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行性能評(píng)估，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將與高技能技術(shù)人員的手動(dòng)操作結(jié)果進(jìn)行比較。

經(jīng)過研究測(cè)試，OT-2 表現(xiàn)優(yōu)異。使用OT-2 進(jìn)行提取的實(shí)驗(yàn)變異 性降低，同時(shí)復(fù)現(xiàn)率提高，并且能在較低的成本和更快的周轉(zhuǎn)時(shí) 間下提供了類似的產(chǎn)量。重要的是，這些性能改進(jìn)和成本節(jié)省可 以隨著吞吐量的增加而提升。因此，該測(cè)試表明，使用 OT-2 進(jìn) 行核酸提取自動(dòng)化可以使實(shí)驗(yàn)流程高效自動(dòng)化，讓自動(dòng)化核酸提取能夠滿足高端分子生物學(xué)的高性能標(biāo)準(zhǔn)。

研究材料和方法
人類唾液： 從匿名捐贈(zèng)者處收集新鮮唾液并儲(chǔ)存在15 mL 錐形管中直至使用。

口腔拭子：使用20 mm break point (Zymo@) 口腔采集拭子對(duì)匿名 志愿者進(jìn)行采樣，并儲(chǔ)存于在1 mL Zymo DNA/RNA 保護(hù)液中，室溫保存運(yùn)輸，

細(xì)菌培養(yǎng)： 使用 One shot°TOP10 制備感受態(tài)大腸桿菌 (Thermo Fisher Scientific*) 在37°℃,225 rpm 振蕩條件下在溶菌液中培養(yǎng)過 夜。使用前，每個(gè)樣品用2000 rpm 離心1.5 分鐘。去除上清液，沉淀物被重新懸浮于等體積的冷磷酸鹽緩沖液中。此外，對(duì)于乳酸桿菌樣品，每個(gè)樣品使用約1×107拷貝/μL的 Lactobacillus plantarum(ATCC°8014MINIPACKTM)。

病毒：由于2020年3月COVID-19 全球大流行開始(1),病毒 RNA 試劑盒中使用了的合成 SARS-COV-2 RNA Control 2(Twist Biosci- ences), 每個(gè)樣品10拷貝/μL。

內(nèi)部對(duì)照：按照 Panpradist、Nuttada 等人(2)中所述使用和創(chuàng)建合 成鼻樣基質(zhì)(SNM)。SNM 的配方為：110 mM NaCl、1%w/v來自豬 胃類型I的粘蛋白(Sigma M2378-100G)和10 μg/mL w/v 人類基 因組DNA(Coriell NA12878), 混合體積為TE/SNM的90%。每個(gè)病毒樣本使用50 pg/μL的 SNM。

試劑盒：本項(xiàng)研究中選擇了來自不同品牌的 DNA、RNA 和病毒 RNA提取試劑盒(參見表1)?？偣矙z驗(yàn)了7個(gè)試劑品牌的13種試劑盒。

提取： 在自動(dòng)化檢測(cè)之前，我們對(duì)每個(gè) DNA 和 RNA 提取試劑及 模板進(jìn)行了手動(dòng)測(cè)試，以獲取手動(dòng)測(cè)試基線濃度。每個(gè)模板在每 種試劑中進(jìn)行7次重復(fù)測(cè)試，并配備1 個(gè)陰性對(duì)照樣本。本次研 究在 Opentrons 平臺(tái)上進(jìn)行了自動(dòng)化核酸提取。對(duì)于 DNA 和 RNA 提取試劑，每個(gè)樣本進(jìn)行了7 次提取。對(duì)于病毒RNA 提取試 劑盒，包括了22 個(gè)帶有相同的 SARS-CoV-2 和 SNM 模板的樣 本。每個(gè) OT-2 運(yùn)行中都包括1個(gè)陰性對(duì)照樣本(nuclease-free H2O) 。OT-2 的設(shè)備裝配了 GEN2 磁珠純化模塊、p300 多通道 移液器和可選配的 GEN2 溫控模塊，對(duì)于 RNA 實(shí)驗(yàn)來說，為保證 更好的實(shí)驗(yàn)效果，建議配備溫控模塊。根據(jù)不同的試劑盒，需要 使用大概14盒300 μL 吸頭，1 個(gè) NEST 的單孔儲(chǔ)液器，1 個(gè)NEST 2 mL深孔板，2個(gè) NEST12 孔儲(chǔ)液槽和1個(gè)PCR 孔板。

引物：疾病控制與預(yù)防中心(CDC)的引物和探針：

2019-nCoV_N1-F(GACCCCAAAATCAGCGAAAT)
2019-nCoV_N1-R (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG)
2019-nCoV_N1-P(FAM-
ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1)
2019-nCoV_N2-F(TTACAAACATTGGCCGCAAA)
2019-nCoV_N2-R(GCGCGACATTCCGAAGAA)
2019-nCoV_N2-P(FAMACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ1)
RP-F(AGATTTGGACCTGCGAGCG),
RP-R(GAGCGGCTGTCTCCACAAGT)
RP-P (FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1)

CDC 引物和探針訂購(gòu)自從Integrated DNA Technologies公司，又名IDT (2019-nCoV CDC EUA試劑盒)。N1、N2 和RNase P以CDC 推薦的濃度進(jìn)行預(yù)混。
16s 引物：
Forward (CCTATAAGACTGGGATAACTTCGGG)
Reverse (CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCG)
16s 引物從IDT 訂購(gòu)，于IDTE 1XTE 溶液 pH:8.0(DT) 中重懸，稀釋至10uM 的工作濃度。

定量測(cè)量： DNA 和 RNA 樣本的濃度可以使用 Qubit 4.0 FluorometerM(Thermo Fisher)進(jìn)行定量測(cè)量。

此外，所有樣品均在 PCR max ECO48 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行 qPCR 定 量。RNA 樣品使用Luna°通用探針一步式 RT-qPCR 試劑盒(NEB) 進(jìn)行 測(cè)試，濃度由 Lista 、Maria Jose 等人測(cè)試(3)。 進(jìn)行以下程序：在 55℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄10分鐘。初始變性在95℃下進(jìn)行1 分鐘，然后進(jìn) 行50個(gè)循環(huán)，即在95℃下變性10秒，并在60℃下退火30秒。使用 Luna Universal qPCR Master Mix (NEB)以制造商推薦的濃度對(duì)DNA樣 品進(jìn)行測(cè)試。使用以下程序：初始變性在95℃下進(jìn)行60秒，隨后變性和延伸分別在95℃和60℃下進(jìn)行15秒和30秒，持續(xù)40個(gè)循環(huán)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過 qPCR 和熒光計(jì)分析測(cè)量， OT-2 提取的核酸數(shù)量接 近，核酸樣品的 一 致性更高。

OT-2 經(jīng)過了符合EUA 標(biāo) 準(zhǔn) 的性能測(cè)試，可以與多種qPCR 核提取試劑盒 一 起使用。

使用九種常用的提取試劑盒處理人類唾液和植物乳桿菌細(xì)菌培養(yǎng) 物，并使用兩種常見的 qPCR 靶標(biāo)進(jìn)行 qPCR 分析： RNase P 用于 唾液樣本，16s 用于細(xì)菌樣本。使用六個(gè)試劑盒處理大腸桿菌培養(yǎng)物并使用熒光分析進(jìn)行分析。

產(chǎn)量通過qPCR 中的循環(huán)閾值(Ct) 和熒光計(jì)中所得的ng/μL進(jìn)行評(píng)估。 一致性則通過Ct值的變異系數(shù) (CV) 進(jìn)行評(píng)估。

Ct值反映了樣品跨過高于背景信號(hào)的閾值所需的復(fù)制周期量，因此 它們傳達(dá)了數(shù)量的倒數(shù)測(cè)量。對(duì)于這些目標(biāo)，在此類樣品中，25-35的 Ct 值較為可靠。

通過所有提取試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)測(cè)試，使用OT-2自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行核酸 提取純化可以得到具有較低CV 和可比產(chǎn)量的Ct值(見圖1和表2)。熟練的技術(shù)人員和OT-2返回的平均Ct值為25-35。

手動(dòng)處理的CV 值為1.41-4.8, OT-2 的CV 值為1.2-2.6。熟練的技術(shù) 人員和OT-2提供了可比且一致的24-26 ng/μL的產(chǎn)量。這些結(jié)果表明， OT-2能夠在提高一致性和重復(fù)性的同時(shí)提供高產(chǎn)量。

在與新冠病毒相關(guān)的測(cè)試中，使用合成的 SARS-CoV-2 樣本和七種 常用的提取試劑盒進(jìn)行了qPCR。 我們使用了 SNM 中的人類基因組 DNA 作為內(nèi)部對(duì)照，使用CDC 的 SARS-CoV-2N1 和 N2 引物進(jìn)行定量分析，同時(shí)使用 CDC 的 RP 引物作為陽(yáng)性對(duì)照。

這項(xiàng)測(cè)試旨在評(píng)估使用不同提取試劑盒在 OT-2 上進(jìn)行新冠病毒 qPCR 分析的性能。通過使用合成的 SARS-CoV-2 樣本以及內(nèi)部對(duì) 照和陽(yáng)性對(duì)照，可以判斷 OT-2 在檢測(cè)病毒基因組的準(zhǔn)確性和可靠性。

對(duì)qPCR 性能的評(píng)估是基于 PCR 檢測(cè)緊急使用授權(quán) (EUA) 標(biāo)準(zhǔn)。 為了滿足 EUA 標(biāo)準(zhǔn)， 一個(gè)測(cè)試必須達(dá)到95%的擴(kuò)增效果，也就是說，在qPCR 中，95%的樣本必須產(chǎn)生可檢測(cè)的N1和N2信號(hào)。

在這種性能評(píng)估中，我們還對(duì) qPCR Ct 值進(jìn)行了評(píng)估。對(duì)于這些目標(biāo)，在這類樣本中，標(biāo)準(zhǔn) Ct值應(yīng)該在30-40之間。

根據(jù)表格 3 的結(jié)果，OT-2 幾乎在所有試劑盒上的表現(xiàn)均通過了 EUA 標(biāo)準(zhǔn)。除了兩個(gè)由于裂解緩沖液過分粘稠導(dǎo)致妨礙了提取過程 的試劑盒只有91%的測(cè)試結(jié)果合格。并且，所有被測(cè)試的試劑中， 樣品結(jié)果均實(shí)現(xiàn)了31-39的標(biāo)準(zhǔn) Ct 值。這些結(jié)果表明，OT-2 系統(tǒng)可以與各種品牌的試劑配套使用，并達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)。

為了測(cè)試OT-2 系統(tǒng)的吞吐量和速度，我們使用了13種熱門試劑盒 進(jìn)行了RNA 和DNA 提取，并覆蓋了不同長(zhǎng)度。為了全面評(píng)估不同吞 吐量下的速度，測(cè)試了每批8、24、48和96個(gè)樣本的情況。以從原始樣品到純化核酸所需的時(shí)間來衡量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在這些提取試劑方案中，OT-2 系統(tǒng)在各種試劑盒和長(zhǎng)度下實(shí)現(xiàn)了 快速提取的結(jié)果。在最短的協(xié)議中，處理8 個(gè)樣本只需要25 分 鐘，在最長(zhǎng)的協(xié)議中，處理96個(gè)樣本不到5小時(shí)(圖2)。對(duì)于8 個(gè)樣本的處理時(shí)長(zhǎng)， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時(shí)間為52分 鐘。而在96個(gè)樣本的情況下， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時(shí)間 為2小時(shí)45分鐘。這些結(jié)果表明， OT-2系統(tǒng)可以將其高性能與高吞吐量相結(jié)合，顯著改善提取工作流程。

研究思考
OT-2 核酸提取工作站從有機(jī)和合成原始模板中提供了優(yōu)質(zhì)的 RNA 和 DNA 樣品。通過 qPCR 和熒光測(cè)試發(fā)現(xiàn)，該自動(dòng)化系統(tǒng)產(chǎn)生的 產(chǎn)出與由高技術(shù)水平操作人員執(zhí)行的手動(dòng)結(jié)果相當(dāng)，并且在實(shí)驗(yàn)復(fù) 現(xiàn)率和精確性方面超過了手動(dòng)操作的性能。研究表明，OT-2 成功 地達(dá)到了滿足緊急使用授權(quán) (EUA) 標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別性能的要求， qPCR 信號(hào)檢測(cè)的成功率超過了95%。時(shí)間測(cè)試顯示，OT-2 處理8個(gè)樣 品的時(shí)間不到1小時(shí)，對(duì)于96個(gè)樣品的處理時(shí)間不到3 小時(shí)，這 是針對(duì)具有不同協(xié)議長(zhǎng)度的試劑盒的平均值。事實(shí)上，使用最快的 試劑盒，OT-2 處理8個(gè)樣品只需要25分鐘，處理96個(gè)樣品僅需1個(gè)半小時(shí)。

應(yīng)用總結(jié)
●對(duì)于中等通量的實(shí)驗(yàn)室來說，光是節(jié)省的時(shí)間就足以讓OT-2
在不到6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)回本。

●OT-2每次處理24個(gè)樣品的提取可節(jié)省3.5小時(shí)的人工操作時(shí) 間。與手動(dòng)操作相比，更高的吞吐量帶來更好的精確性、減少
的變異性和提高的可重復(fù)性。

●這種高性能可以促進(jìn)更好的質(zhì)量控制，減少下游數(shù)據(jù)的變異 性。此外，消除了繁瑣的人工操作程序可以減少錯(cuò)誤，并降低
因?yàn)槭褂冒嘿F試劑重復(fù)運(yùn)行程序而產(chǎn)生的成本。

這些測(cè)試都是在具有臨床和實(shí)驗(yàn)室意義的多個(gè)樣品以及各種不同的提取試劑盒中進(jìn)行的。OT-2 的靈活性使其能夠適應(yīng)各種協(xié)議、試劑和樣本類型，以持續(xù)提供優(yōu)質(zhì)的結(jié)果。