摘要
檢測SARS-CoV-2中和抗體的可靠血清學(xué)檢測是公共衛(wèi)生和臨床目的的有用工具。用于檢測中和抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISAs）已從FDA頒發(fā)了緊急使用授權(quán)（EUA）。除了傳統(tǒng)的elisa抗體（如RBD）抗原偶聯(lián)磁珠基elisa被固定在96孔板的表面，已經(jīng)成為一種具有幾個優(yōu)點(diǎn)的替代方法。我們有開發(fā)了一種基于珠子的ELISA，用于檢測SARS-CoV-2中和抗體。這種方法需要單獨(dú)的儀器來執(zhí)行主要步驟，如液體轉(zhuǎn)移，清洗和搖晃。在OT-2平臺上簡化了該實驗磁模塊和加熱器搖振器，一個協(xié)議設(shè)計和檢測，以處理收集自COVID-19患者的血清樣本。從ACROBio系統(tǒng)公司獲得的RBD偶聯(lián)磁珠也進(jìn)行了測試并對使用相同的協(xié)議進(jìn)行了比較。

主要調(diào)查結(jié)果
配備了磁性模塊和加熱震器模塊的OT-2展示了對SARS-CoV-2進(jìn)行珠狀elisa的能力中和性抗體檢測精度較高。
在更高的吞吐量設(shè)置中，該協(xié)議可以用最少的動手時間處理多達(dá)96個樣品。

介紹
例如，在識別出病毒成分后，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)會觸發(fā)針對病毒抗原的中和抗體的分泌
存在核衣殼(N)蛋白和刺突(S)蛋白治療嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）?？贵w檢測可用于檢測由于病毒感染而導(dǎo)致的血清中這些中和抗體的存在，提供解決人群或過去SARS-CoV-2感染的信息，以更好地了解SARS-CoV-2的流行病學(xué)。這些測試是在臨床試驗中確定疫苗效力的常用工具以及在大規(guī)模接種疫苗之后。
抗體測試通常使用酶印免疫吸附試驗（ELISA），一種技術(shù)它可以檢測和量化目標(biāo)分子抗體)通過高度特異性的抗體-抗原相互作用。對于一個典型的夾層ELISA用于抗體檢測，第一步是將SARS-CoV-2抗原附著在固體表面96孔或12孔的條紋，它們可以組裝在一個與96孔酶標(biāo)儀兼容的框架上。然后這些樣本被添加到井中，以及抗sars-CoV-2抗體通過與抗原結(jié)合而捕獲并固定。檢測抗體，通常是一種能識別人IgG并攜帶辣根的抗體使用過氧化物酶（HRP），并在酶的底物的存在下，產(chǎn)生一個比色信號并且可以被測量和量化。吸光度與樣品中抗sars-cov-2中和抗體的水平成正比。
或者，磁珠也可以作為elisa中的固體表面。其優(yōu)點(diǎn)包括一個增加的在整個樣品處理過程中，可用的表面積和珠子的均勻分布，可以實現(xiàn)更快速和靈敏的檢測低分析物濃度。我們開發(fā)了一種基于珠子的ELISA，用于檢測SARS-CoV-2病毒的中和抗體。該檢測方法利用了SARS-CoV-2的受體結(jié)合域（RBD）S蛋白作為捕獲抗原，賽默費(fèi)雪herDynabeads（沃爾瑟姆，MA，USA）作為固體表面。
盡管檢測設(shè)計多樣，elisa通常遵循類似的工作流。一般步驟包括試劑轉(zhuǎn)移、孵育和重復(fù)洗滌。基于珠的elisa程序需要單獨(dú)的儀器來執(zhí)行這些步驟，這可能在Opentrons OT-2平臺上自動化磁性模塊和加熱器振動器。我們開發(fā)了一個簡化檢測方案，以避免多種儀器的需要，并減少實際操作時間。該方案還使用ACROBio系統(tǒng)公司的RBD偶軛磁珠（Newark，DE，USA）進(jìn)行驗證，以確認(rèn)OT-2樣品處理的質(zhì)量。

材料和方法
在視中心OT-2上測試的ELISA示意圖，完成分析的步驟大綱，以及甲板布置圖（圖1）
將60 μg SARS-CoV-S-2S蛋白his標(biāo)記RBD結(jié)合制備RBD偶聯(lián)珠（acro生物系統(tǒng)公司，紐瓦克，DE，美國）至5毫克迪納比德（賽默費(fèi)舍爾，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國），超順磁性球形聚合物粒子為磁分離生物材料，然后儲存在2.5 mL的封閉緩沖液中。相同的協(xié)議也是通過使用市售的RBD進(jìn)行測試的嗎美國生物系統(tǒng)的預(yù)涂層珠(36 μg RBD每毫克珠子）。人抗sars-cov-2S1抗體作為標(biāo)準(zhǔn)抗體和小鼠單克隆抗人抗體以HRP偶聯(lián)作為檢測抗體的IgG Fc購自細(xì)胞科學(xué)公司（紐伯里波特，MA，美國）和Abcam公司（劍橋，英國），定制的檢測緩沖液分別由. 特諾瓦（霍利斯特，加利福尼亞州，美國）。
液體轉(zhuǎn)移由8通道移液管進(jìn)行。ELISA板被放置在磁模塊上，并手動移動到加熱器模塊如果需要攪拌。本研究獲得了以前檢測為SARS-CoV-2抗體陽性或陰性的血清樣本。實驗完成后，立即用比色平板儀在450 nm波長下測定每個樣品的吸光度。的運(yùn)行時對不同樣本量下的每種檢測方法進(jìn)行了估計（表1）。

結(jié)果
為了生成測試的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在OT-2上，用50 μL的RBD偶聯(lián)珠子懸液進(jìn)行檢測轉(zhuǎn)移到96孔2 mL深孔板的每個孔中，預(yù)裝有連續(xù)2倍稀釋的人抗-SARS-CoV-2 S1抗體，檢測方法見材料和方法。測量了吸光度，并進(jìn)行了劑量反應(yīng)曲線繪制。結(jié)果表明，OT-2進(jìn)行該檢測的精度（CV<10%）（圖2A），并且在100 ng/mL到ng/mL之間的檢測讀數(shù)與抗體濃度之間存在極好的線性關(guān)聯(lián)12.5 ng/mL（r平方>0.99）（圖2B）。

來自宏宏生物系統(tǒng)的RBD預(yù)涂層珠然后重組（每mL阻斷緩沖液1mg珠子），并在OT-2上使用相同的方案進(jìn)行測試。制備連續(xù)2倍稀釋的人抗sars-cov-2S1抗體，并暴露于20 μL面包懸液中。這些數(shù)據(jù)被用于繪制劑量-反應(yīng)曲線，以供進(jìn)一步分析。OT-2上樣品處理的一致性（CV<10%）（圖3A）和檢測讀數(shù)與抗體濃度的線性關(guān)系均得到了證實（100 ng/mL至6.25 ng/mL，r平方>0.99）（圖3B）。

為了進(jìn)行基于珠子的ELISA，以確定SARS-CoV-2 S1中和抗體的水平，該方案設(shè)計用于RBD偶聯(lián)珠子的制備房子或美國生物系統(tǒng)公司的RBD共軛面包是用于處理之前由傳統(tǒng)的、fda認(rèn)證的ELISA檢測的血清樣本（陽性： *）。結(jié)果再次顯示了OT-2液體處理的精度（CV <為10%）和抗體濃度根據(jù)圖4所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。

對OT-2抗體的抗體中和試驗

在OT-2上的基于珠子的ELISA

結(jié)論
基于珠的elisa可以在配備磁模塊和的OT-2平臺上成功進(jìn)行加熱器振動器模塊。結(jié)果表明優(yōu)良的樣品處理質(zhì)量，該方案適合處理最少的多達(dá)96個樣品實際操作時間。