現(xiàn)代數(shù)據(jù)分析方法（例如優(yōu)化算法或深度學習）已成功應(yīng)用于許多生物技術(shù)和醫(yī)學問題。為了使這些方法有效，需要進行大量高質(zhì)量且可重復(fù)的實驗，這需要高度自動化。在這里，我們介紹了一種開源硬件和低成本框架，可以自動高通量生成大量細胞生物學數(shù)據(jù)。我們的設(shè)計包括一個落射熒光顯微鏡，該顯微鏡帶有自動 XY 載物臺，用于移動裝有細胞的多孔板，以及一個灌注歧管，允許編程應(yīng)用多達八種不同的溶液。我們的系統(tǒng)非常靈活，可以輕松適應(yīng)個人實驗需求。為了證明該系統(tǒng)的實用性，我們已使用它進行高通量 Ca 2+成像和大規(guī)模熒光標記實驗。

介紹
過去十年發(fā)展起來的深度學習和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (ANN) 已被證明可用于圖像分析、優(yōu)化任務(wù)和機器人技術(shù)（LeCun 等人，2015 年；Hinton，2018 年；Hinton 等人，2019 年）。它們在解決生物問題方面也越來越受歡迎。例如，基于 ANN 的細胞分割算法比傳統(tǒng)方法更準確、更快（Hilsenbeck 等人，2017 年）。深度學習還有助于檢測人體組織中的轉(zhuǎn)化細胞（Van Valen 等人，2016 年；Coudray 等人，2018 年）、優(yōu)化治療條件（Kusumoto 和 Yuasa，2019 年）以及解釋動物行為（Heras 等人，2019 年）。最近，已經(jīng)開發(fā)了一個在線平臺，讓沒有任何深度學習知識的研究人員可以在自己的應(yīng)用程序中使用它（von Chamier 等人，2020 年），進一步提高了深度學習作為分析工具的實用性。

應(yīng)用深度學習和其他機器學習方法時，一個重要的考慮因素是訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的大小。通常，深度學習需要數(shù)千到數(shù)萬個數(shù)據(jù)點（O'Mahony 等人，2019 年）。這在生物實驗中通常是不可行的，因為它們通常需要很長時間才能完成。因此，需要能夠在最少的人工監(jiān)督下執(zhí)行數(shù)百或數(shù)千個實驗的自動化系統(tǒng)。這種自動化系統(tǒng)應(yīng)允許 (a) 在多個孔中進行單細胞顯微鏡檢查（明場和/或熒光）（即具有 XY 載物臺）；(b) 自動應(yīng)用多種不同的解決方案；(c) 自動在線分析（例如，細胞分割和平均亮度的計算）。

市售熒光顯微鏡（例如 Olympus BX61、Nikon Ti Widefield 或 Nikon A1 共聚焦系統(tǒng)，以及活細胞成像系統(tǒng)，例如 Echo Revolve 或 Sartorius Incucyte）通常配備 XY 載物臺，可進行多孔熒光成像。然而，這些系統(tǒng)價格昂貴（15,000-150,000 英鎊），并且僅提供有限的自動化解決方案應(yīng)用功能。許多市售系統(tǒng)（例如 Hamilton 或 Andrew）都允許這樣做，但由于其尺寸和成本，這些系統(tǒng)很難與實時成像相結(jié)合。

3D 打印以及 Arduino 和 Raspberry Pie 等廉價電子設(shè)備的發(fā)展引發(fā)了定制經(jīng)濟實惠的科學設(shè)備的革命，而這些設(shè)備以前只能在大型實驗室或大學設(shè)施中使用。這些設(shè)備不僅經(jīng)濟實惠，而且可以根據(jù)各個實驗室的需求進行定制。此類技術(shù)的一個例子是Baden 等人（2015 年）和Maia Chagas 等人（2017 年）開發(fā)的labware.net，它允許 3D 打印極其便宜的實驗室設(shè)備，從標準可用的微量移液器和微操作器到熒光顯微鏡和光遺傳學解決方案。

最近開發(fā)了幾種開源高質(zhì)量顯微鏡。例如，Diederich 等人 (2020)開發(fā)了一個可定制的 3D 打印開源框架，可用于構(gòu)建各種顯微鏡：從具有自動對焦功能的簡單明場顯微鏡到具有樣品光學切片功能的更復(fù)雜的系統(tǒng)。然而，這些資源缺乏用于掃描大量樣本的開源系統(tǒng)。Sharkey 等人(2016)針對小動作解決了這個問題，Merces 等人 (2021)針對多孔板的穩(wěn)健成像解決了這個問題。然而，這些解決方案不提供任何細胞操作，盡管最近已經(jīng)開發(fā)了開源液體處理解決方案（例如，Wijnen 等人，2014 年；Almada 等人，2019 年；Amarante 等人，2019 年；Booeshaghi 等人，2019 年；Samokhin，2020 年；Baas 和 Saggiomo，2021 年）。

在這里，我們介紹了一個開源系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合了多孔板中的高通量顯微鏡、自動化溶液應(yīng)用、同步熒光成像和圖像分析。它成本低（不帶熒光顯微鏡的價格為 400-600 英鎊，帶熒光顯微鏡的價格為 2,500 英鎊），完全可定制，并且最多可以連續(xù)進行 96 或 384 個實驗，如果實驗不需要高采樣率（例如每分鐘 1 幀或更高），則可以同時進行。該平臺配備一個單通道落射熒光顯微鏡頭，可用于對動態(tài)熒光報告基因（例如 GCaMP 和合成鈣染料；Razlivanov 等人，2018 年）和/或用熒光抗體或染料標記的樣品進行成像。我們展示了我們的系統(tǒng)如何在嚴格控制和可重復(fù)的實驗條件下大規(guī)模快速生成細胞生物數(shù)據(jù)。

結(jié)果
典型的細胞生物學實驗范例通常涉及用生物活性化合物（例如生長因子、鈣動員激動劑和細胞毒性劑）處理細胞，并使用熒光報告基因監(jiān)測細胞行為或固定細胞以便隨后進行免疫熒光標記或基因表達分析。為了使此類實驗自動化，我們開發(fā)了一個實驗平臺，該平臺允許自動對 96 孔板進行成像并使用注射泵應(yīng)用八種溶液。我們首先介紹該平臺并展示其適用性，然后更詳細地描述硬件、軟件和系統(tǒng)性能。

自動化平臺及其適用性
完整組裝的系統(tǒng)如圖1A所示。硬件由幾個主要模塊組成：水平移動多孔板的 XY 平臺；帶有自動對焦系統(tǒng)的小型熒光顯微鏡（補充視頻 1）；以及將八種溶液應(yīng)用到各個孔中的灌注歧管（補充視頻 2）。構(gòu)建說明和所有 3D 打印文件可在https://github.com/frescolabs/FrescoM獲得（另見補充文本）?？梢允褂?Python 編寫的用戶界面操作硬件（圖 1B，有關(guān)詳細信息，請參閱“軟件”部分），該界面控制平臺、物鏡和歧管以及自動對焦、曝光、照明和實驗方案的整體管理。

為了展示該平臺，我們首先演示了它如何用于大規(guī)模熒光成像實驗（Nasu et al., 2021）。涉及熒光報告基因的典型實驗方案需要在應(yīng)用激動劑、生長因子或其他活性化合物之前和之后對細胞進行一段時間的成像。為了證明開發(fā)的實驗平臺對這種實驗范式的可用性，我們使用合成的鈣濃度熒光指示劑進行了鈣成像。細胞自動用熒光鈣染料 Fluo4-AM 標記（圖 1C），并響應(yīng) 100 μm ATP 進行鈣成像。然后使用 Cellpose 算法（Stringer et al., 2021 ）自動分割細胞（圖 1C ，右） ，并提取單個細胞的熒光動力學（圖 1D）。然后在其他 30 個孔中自動重復(fù)相同的實驗程序和分析（圖 1E、F和補充視頻 3）。這些實驗表明，開發(fā)的平臺可以實現(xiàn)熒光報告基因的穩(wěn)健和自動高通量成像。

所開發(fā)系統(tǒng)的另一個重要優(yōu)勢是它允許在大量孔中大規(guī)模生成圖像。 為了證明這種可用性，我們生成了一個 Python 協(xié)議類（補充協(xié)議 1，有關(guān)詳細信息，請參閱“軟件”部分），使平臺在所有 96 個孔上移動，對每個細胞進行聚焦，并捕獲明場或熒光圖像。 此類實驗的示例如圖2A、B所示。 重要的是，該系統(tǒng)允許掃描單個孔并對同一個孔生成多張圖像（圖 2C），這對于尋找稀有細胞（例如，正在進行有絲分裂/凋亡的細胞或轉(zhuǎn)染效率低下的陽性細胞）很有用。

為了證明所開發(fā)的實驗平臺在標記實驗中的可用性，我們使用了熒光小麥胚芽凝集素 (WGA)，該物質(zhì)可突出顯示細胞膜。用 PBS 自動清洗五排孔（共 48 個孔），然后加入含有 5 mg/ml 熒光 WGA 的溶液。室溫下放置 10 分鐘后，用 PBS 清洗 WGA，然后放入熒光顯微鏡下觀察。得到的熒光圖像如圖2D所示。自動標記可產(chǎn)生具有明確質(zhì)膜的細胞的清晰圖??像，從而表明可以使用所開發(fā)的平臺自動執(zhí)行常規(guī)標記程序。

最后，我們還測試了所開發(fā)的平臺是否可用于以抗 HER2 抗體（Herceptin）為一抗、以 Alexa 488 偶聯(lián)的二抗進行免疫熒光染色。用 PBS 和 Herceptin 自動灌注含有 SKBR3 細胞（HER2 高表達）或 HeLa 細胞（HER2 低表達）的孔。室溫下孵育 40 分鐘后，用 PBS 灌注細胞，然后用二抗灌注。室溫下再孵育 30 分鐘后，用成像溶液灌注孔并進行熒光成像（圖 2E和補充圖 1）。得到的圖像顯示，HER2 水平高的 SKBR3 細胞的細胞膜標記清晰，但受體水平低的 HeLa 細胞的細胞膜標記不清晰，從而證明了自動標記程序的穩(wěn)健性。

這些示例證明了所開發(fā)的實驗平臺在不同類型的細胞生物學實驗自動化方面的廣泛可用性。下面，我們將詳細描述該平臺并在一系列測試中展示其性能。

硬件設(shè)計
整體結(jié)構(gòu)由 MakerbeamXL 15 毫米 × 15 毫米擠壓件構(gòu)成，通過 L 形和 T 形鋁制支架或 3D 打印部件連接。我們發(fā)現(xiàn)使用鋁擠壓框架代替完全 3D 打印部件（兩種型號均可在https://github.com/frescolabs/FrescoM上找到）可以使整個系統(tǒng)更穩(wěn)定并減少振動（未顯示數(shù)據(jù)）。框架由八個側(cè)面擠壓件組成（四個垂直 300 毫米和三個水平 200 毫米，兩個在頂部，一個在底部，圖 3A）。側(cè)面與兩個 400 毫米擠壓件相連，用于固定驅(qū)動x軸的 MGH12 導(dǎo)軌。y軸（圖 3B）位于由四個 200 毫米擠壓件構(gòu)成的方形框架上，并通過兩個 3D 打印支架連接到x軸。兩個 MGH12 導(dǎo)軌位于框架上，可容納一個 Nema 17 電機和一個 96 孔板支架（圖 3B，y_plate_holder.stl 文件）。