1 引言
鑒于對數(shù)據(jù)可靠性的顧慮，以及無法重現(xiàn)已發(fā)布的研究結(jié)果，生命科學(xué)正陷于“重現(xiàn)性危機(jī)”之中。大多數(shù)科研人員報(bào)告稱未能重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)（包括其本人的實(shí)驗(yàn)），因此需要采取更多步驟來改善已發(fā)布的研究結(jié)果的可靠性與可信度。但是，有哪些因素導(dǎo)致了這種科學(xué)“危機(jī)”，應(yīng)如何實(shí)施簡單的移液解決方案來應(yīng)對這一危機(jī)？本白皮書概述了重現(xiàn)性危機(jī)的嚴(yán)重程度，探討了造成實(shí)驗(yàn)無法重現(xiàn)的五個(gè)主要因素，并討論了良好的移液器選擇和技術(shù)如何避免因液體處理不準(zhǔn)確而導(dǎo)致可重現(xiàn)性差的問題。

2 數(shù)據(jù)重現(xiàn)性危機(jī)
重現(xiàn)性不僅僅是特定時(shí)間、地點(diǎn)或人物的人為現(xiàn)象，它還是科學(xué)方法的基石，是確認(rèn)所觀察到的結(jié)果是否符合假設(shè)的必要條件。科學(xué)界依靠同行評審出版流程來確?？蒲谐晒麥?zhǔn)確無誤，這意味著從表面上看，大多數(shù)科研成果一經(jīng)發(fā)布便很少受到質(zhì)疑。因此，很少有人會重復(fù)這些研究，已發(fā)布研究結(jié)果即被視為事實(shí)，而研究領(lǐng)域則可能建立在一個(gè)不可重現(xiàn)的研究結(jié)果之上。我們目前注重減少在科學(xué)研究中使用動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（比如“3 R”框架，通過動物替代、動物減少和研究改進(jìn)來進(jìn)行更人道的動物研究），而這進(jìn)一步加劇了這一現(xiàn)象。這一框架建議優(yōu)先考慮“真正進(jìn)入知識庫”的研究，但這卻無法促進(jìn)現(xiàn)有知識的重現(xiàn)。然而，如果特定研究結(jié)果無法在不同環(huán)境下由不同人員重現(xiàn)，則我們不能這一結(jié)果視為真正的科學(xué)現(xiàn)象，只能將其視為特定實(shí)驗(yàn)條件下的產(chǎn)物。

John Ioannidis于2005年發(fā)表了題為“為何大多數(shù)已發(fā)表的研究結(jié)果都是錯(cuò)誤的”(1) 的期刊文章，此文頗具爭議，（生物）醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的可重現(xiàn)性危機(jī)由此成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。模擬與建模結(jié)果表明，對于大多數(shù)研究設(shè)計(jì)而言，已發(fā)布研究結(jié)果很可能是錯(cuò)誤的，它們只是當(dāng)前普遍偏差下的準(zhǔn)確測量結(jié)果。

近二十年前就有人提出了數(shù)據(jù)重現(xiàn)性問題，如今這一問題仍然普遍存在。近期，《自然》的一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果顯示，70%以上的科研人員報(bào)告稱未能重現(xiàn)已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (2)。而令人擔(dān)憂的是，50%以上的科研人員報(bào)告稱未能重現(xiàn)自己的實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)在大家一致認(rèn)為，這一問題非常嚴(yán)重，已經(jīng)導(dǎo)致生物學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域深陷重現(xiàn)性危機(jī)。大多數(shù)研究人員表示，盡管自己認(rèn)同這一觀點(diǎn)，但還是相信已發(fā)表的文獻(xiàn)。

重現(xiàn)性危機(jī)不僅擾亂了基礎(chǔ)科學(xué)的知識庫，還嚴(yán)重影響了工業(yè)應(yīng)用的開發(fā)計(jì)劃。顯然，我們需要利用解決方案來提高數(shù)據(jù)可靠性和解決科學(xué)領(lǐng)域的重現(xiàn)性危機(jī)，但有哪些因素會導(dǎo)致缺乏可重現(xiàn)性？

3 影響數(shù)據(jù)重現(xiàn)性的因素
想要應(yīng)對重現(xiàn)性危機(jī)，首先要承認(rèn)科學(xué)界存在數(shù)據(jù)重現(xiàn)性問題，然后應(yīng)該考慮和了解影響數(shù)據(jù)可靠性的主要因素，再在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中（從初始規(guī)劃到實(shí)驗(yàn)程序和最終分析）采取步驟來避免這些因素。

3.1 文化
可以說，沒有察覺到研究不可重現(xiàn)的主要原因在于，當(dāng)前科學(xué)文化不鼓勵(lì)發(fā)表負(fù)面研究結(jié)果?？蒲腥藛T無法重現(xiàn)某一實(shí)驗(yàn)通常是因?yàn)闆]有正確進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、缺乏必要技能，或是因?yàn)榭捎梅椒ǚ桨傅募?xì)節(jié)不足以支持重現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)。然而，即使在眾多實(shí)驗(yàn)室成員在嘗試多次仍然失敗后認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)不可重現(xiàn)，各雜志也可能不愿意發(fā)表負(fù)面研究結(jié)果。即使發(fā)表了，負(fù)面研究結(jié)果也通常會被視為具有爭議且會被反駁。正如《自然》的調(diào)查結(jié)果中所述，“數(shù)位曾公開發(fā)表實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)失敗結(jié)果的受訪者表示，編輯和審稿人要求將這些研究和初始研究進(jìn)行比較。”但知名期刊認(rèn)識到了這個(gè)問題，因而發(fā)表負(fù)面研究結(jié)果比以往更容易，其中包括雜志PLOS One雜志的特刊“The Missing Pieces：負(fù)面結(jié)果、無結(jié)果和無法得出結(jié)論的研究結(jié)果”文章合集 (3)。

3.2 強(qiáng)調(diào)P值
研究中不可重現(xiàn)率較高很可能是因?yàn)檠芯咳藛T根據(jù)在單項(xiàng)研究中觀察到的統(tǒng)計(jì)顯著性（通常P值小于0.05）聲稱得出結(jié)論性結(jié)果。顯著性P < 0.05這一黃金標(biāo)準(zhǔn)也可能會導(dǎo)致研究人員錯(cuò)誤地解讀錯(cuò)誤的結(jié)果，這一標(biāo)準(zhǔn)不一定能夠確認(rèn)研究結(jié)果具有實(shí)踐意義和重要意義，也無法表明在其他地方進(jìn)行同一實(shí)驗(yàn)時(shí)數(shù)據(jù)是否仍然具有顯著性。依靠是否達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性來認(rèn)定某項(xiàng)研究是否值得發(fā)表，導(dǎo)致了科研人員采取“p值操縱”的做法 (4)。這種惡意行為可能包括設(shè)計(jì)和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過數(shù)據(jù)疏浚、數(shù)據(jù)捕魚、數(shù)據(jù)挖掘或數(shù)據(jù)捕獲來確保結(jié)果具有顯著性或利用數(shù)據(jù)分析。

3.3 缺乏透明度和原始數(shù)據(jù)
僅在最近幾年，才開始鼓勵(lì)向研究人員提供對研究背后原始數(shù)據(jù)的完全訪問權(quán)限。然而，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，因?yàn)檠芯砍晒梢酝ㄟ^商業(yè)化產(chǎn)生巨大財(cái)富，數(shù)據(jù)收集和分析的具體方式仍然缺乏透明度。老實(shí)說，期刊文章有字?jǐn)?shù)限制，因此在很多情況下難以包含成功重現(xiàn)復(fù)雜實(shí)驗(yàn)所需的所有方法細(xì)節(jié)。而在其他需要考慮商業(yè)前景或知識產(chǎn)權(quán)前景的領(lǐng)域，原稿中可能會刪除或混淆專有信息。如果原始數(shù)據(jù)本身提供了有價(jià)值的產(chǎn)物（例如影響藥物研發(fā)的基因組數(shù)據(jù)庫），則這些數(shù)據(jù)通常會出于商業(yè)原因處于保密狀態(tài)。因此，外部研究人員無法獨(dú)立驗(yàn)證已發(fā)布的研究結(jié)果，從而無法確定該結(jié)果是否具有可重現(xiàn)性和結(jié)論性。

3.4 實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和記錄保存不當(dāng)
從較為基本的層面來講，實(shí)驗(yàn)不可重現(xiàn)可能是因?yàn)槌跏紝?shí)驗(yàn)科研人員和重復(fù)實(shí)驗(yàn)科研人員的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)不佳，他們應(yīng)該盡可能采用標(biāo)準(zhǔn)方式來施用技術(shù)，以便其他科研人員也可以使用這些技術(shù)。如果針對某一特定方案（可能無法通過文本方案來理解）開發(fā)了新技術(shù)，則可以隨附視頻教程。細(xì)小步驟可能會被忽略，沒有包含在已發(fā)布的方法方案中，因此，記錄不詳細(xì)也會影響可重現(xiàn)性。

3.5 非標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備的質(zhì)量各異
多種可用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和儀器也會影響方案的標(biāo)準(zhǔn)化。不同品牌儀器的整體功能也許相似，但其精度可能各有不同。不同品牌之間靈敏度、特異度、檢測水平等方面的差異可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。因此，需要提供詳細(xì)的材料和設(shè)備清單以及已發(fā)布的方案，明確說明所用物品的品牌、型號、批號等信息。應(yīng)盡可能使用優(yōu)質(zhì)設(shè)備和材料，以減少可能與更廉價(jià)材料相關(guān)的差異。設(shè)備未經(jīng)校準(zhǔn)以及在科研人員不知情的情況下更改實(shí)驗(yàn)參數(shù)都可能會進(jìn)一步加劇這些問題。

4 通過易于實(shí)施的移液解決方案提高重現(xiàn)性
重現(xiàn)性危機(jī)是一大系統(tǒng)性問題，科學(xué)方法的許多階段都需要考慮這一問題并采取解決方案，但可以從改進(jìn)簡單過程開始來提高數(shù)據(jù)可靠性。改進(jìn)涉及多個(gè)科學(xué)工作流程階段的過程可以提高數(shù)據(jù)可靠性，從而獲得高回報(bào)。

我們的使命是創(chuàng)建可靠且易于驗(yàn)證的高精度儀器，以幫助研究人員實(shí)現(xiàn)可重現(xiàn)的科學(xué)。手動移液是一種容易忽略的生命科學(xué)工具，這種工具要求準(zhǔn)確度要精確到微升級，可以說在所有過程中都使用得比較多，因此是提高可重現(xiàn)性的關(guān)鍵過程。幸運(yùn)的是，移液解決方案操作簡單且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，對整個(gè)工作臺工作流程中都有著積極影響。

4.1 選擇優(yōu)質(zhì)移液器
如要實(shí)現(xiàn)可重現(xiàn)移液，要先選擇在整個(gè)移液循環(huán)（吸液和分液）中都準(zhǔn)確無誤的優(yōu)質(zhì)移液器。移液器的真實(shí)值（亦稱作準(zhǔn)確度）是指吸取和分配接近容量設(shè)置所示的真實(shí)值或標(biāo)稱值溶液容量的能力。移液器的精度是指在多次重復(fù)操作中分配相同容量溶液的能力。因此，可以通過平衡高真實(shí)值和/或高精度來實(shí)現(xiàn)移液器的整體移液性能，從而分別實(shí)現(xiàn)低系統(tǒng)誤差和/或低隨機(jī)誤差。

選擇優(yōu)質(zhì)移液器后，仍有多種因素會對準(zhǔn)確度
產(chǎn)生負(fù)面影響：

• 用戶技術(shù)
• 環(huán)境因素（包括溫度、濕度和壓力）
• 液體樣品特性（即高粘度）
• 儀器誤差
  盡管這些因素難以控制，但使用高端儀器對于提高移液器的性能而言是簡單易行的解決方案。

所選移液器應(yīng)采用先進(jìn)的制造工藝，以達(dá)到能夠保持長期準(zhǔn)確（真實(shí)值和精度）的允差。購買新的移液器時(shí)，應(yīng)比較供應(yīng)商之間所述的系統(tǒng)誤差規(guī)格和隨機(jī)誤差規(guī)格。
為說明不同品牌之間的差異，表1比較了2 μL、20 μL、200 μL和1000 μL 標(biāo)稱值范圍內(nèi)高端移液器和低端移液器之間的技術(shù)規(guī)格?？傮w而言，高端儀器的隨機(jī)誤差性能更佳。此外，應(yīng)特別注意低容量移液器 — 即分液容量小于10 μL的移液器，因?yàn)橐埔杭夹g(shù)和樣品粘度對低容量分液的負(fù)面影響較大，會導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低和預(yù)期容量減小。因此，用戶應(yīng)選擇出廠時(shí)儀器誤差較小的移液器。

對于精度和重復(fù)性要求較高的分子工作流程（如逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，RT-PCR）來說，劣質(zhì)儀器相對較低的精度會對實(shí)驗(yàn)的可重現(xiàn)性產(chǎn)生顯著影響。

4.2 確保正確實(shí)施日常維護(hù)、校準(zhǔn)與性能驗(yàn)證
移液器是實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的設(shè)備，經(jīng)常遭受磨損。移液器由多種機(jī)械零件構(gòu)成，這些零件彼此可以移動，經(jīng)常會接觸到腐蝕性化學(xué)物質(zhì)或有害化學(xué)物質(zhì)。和所有其他機(jī)械性產(chǎn)品一樣，移液器零件會隨著時(shí)間的推移而劣化，進(jìn)而嚴(yán)重影響移液器性能。高端的移液器和儀器可以保證比低價(jià)的替代品更經(jīng)久耐用，但它們?nèi)匀恍枰ㄆ诰S護(hù)、驗(yàn)證和校準(zhǔn)，以確保在實(shí)驗(yàn)中保持始終如一的性能和可重現(xiàn)性。

移液器維護(hù)
移液器維護(hù)包括日常保養(yǎng)和預(yù)防性維護(hù)。妥善保養(yǎng)移液器可以盡量提高維修間隔期間的性能、防止移液器因損壞而無法使用?？梢赃M(jìn)行簡單的日常活動，以確保移液器正常工作。

定期檢查移液器是否存在任何可見的損壞跡象，例如移液器外殼有劃痕或破損。這一活動可以指示移液器是否掉落，移液器掉落可能會導(dǎo)致?lián)p壞，并且需要維修或校準(zhǔn)。

定期清潔移液器，以防灰塵或污垢進(jìn)入工作件，進(jìn)而導(dǎo)致工作件摩擦或卡住。使用制造商推薦的無磨蝕性清潔溶液清潔移液器，然后使用無絨布擦拭移液器。

正確消毒移液器（將暴露在紫外光下的時(shí)間限制在10-15分鐘），以免移液器外殼的完整性受損。持續(xù)高壓滅菌導(dǎo)致移液器經(jīng)常暴露在高溫、高壓和高濕度條件下，這也可能會影響其性能，因此應(yīng)在每次高壓滅菌后進(jìn)行性能驗(yàn)證。

安全存放移液器，將其置于合適的盒裝或平臺裝置中，以防掉落和損壞。

切勿倒置移液器（液體處理期間），以免液體進(jìn)入儀器。濾芯吸頭有助于防止液體和污染物進(jìn)入移液器。

日常保養(yǎng)移液器有助于在維修間隔期間維持移液器性能，但預(yù)防性維護(hù)對于防止移液器突然故障仍然至關(guān)重要。Rainin服務(wù)數(shù)據(jù)顯示，如果沒有進(jìn)行任何預(yù)防性維護(hù)或執(zhí)行定期維修程序，那么即使每年都進(jìn)行檢查，移液器的故障率仍會達(dá)20%或以上。大約95%的移液器故障都是因?yàn)槊芊庀到y(tǒng)缺陷，這種故障可以預(yù)測，也可以預(yù)防。預(yù)防性維護(hù)旨在更換磨損的組件（比如O形圈、密封件和柱塞），以免其發(fā)生故障并進(jìn)一步損壞周圍部件。

根據(jù)制造商的建議和我們的豐富經(jīng)驗(yàn)，在正常使用條件下，密封件應(yīng)每年至少更換一次，而吸頭支架和活塞應(yīng)每三到五年更換一次。預(yù)防性維護(hù)有助于確保維持移液器性能、防止移液器故障和保持實(shí)驗(yàn)合規(guī)和可重現(xiàn)，進(jìn)而避免工作流程中斷。

校準(zhǔn)
建議每年至少進(jìn)行一次預(yù)防性維護(hù)，以確保移液器功能操作正常，但需要增加移液器的校準(zhǔn)頻率，以確保其準(zhǔn)確度保持在（亞）微升級。真實(shí)的吸液量和分液量無從知曉，因此移液器校準(zhǔn)不當(dāng)會顯著降低實(shí)驗(yàn)的可重現(xiàn)性，進(jìn)而導(dǎo)致已發(fā)布的實(shí)驗(yàn)方案不準(zhǔn)確。