一、二代測序簡介
1.第二代測序（Next-generation sequencing，NGS）：又稱為高通量測序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測序技術(shù)。
2.一代測序為合成終止測序，而二代測序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實現(xiàn)邊合成邊測序。
3.二代測序在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記（一般為熒光分子標記）來確定DNA的序列。

4.現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。
5.由于在二代測序中，單個DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然后進行同步復制，來增強熒光信號強度從而讀出DNA序列；而隨著讀長增長，基因簇復制的協(xié)同性降低，導致堿基測序質(zhì)量下降，目前二代最長的讀長是miseq的600bp。
6.二代測序適合擴增子測序（例如16S、18S、ITS的可變區(qū)），而基因組、宏基因組DNA則需要使用鳥槍法打斷成小片段，測序完畢后再使用生物信息學方法進行拼接。
鳥槍法：將大分子的目標DNA隨機地處理成大小不同的小片段進行測序，并在后續(xù)的生物信息學分析中將這些短序列組裝成目標DNA的技術(shù)方法。
傳統(tǒng)方法：使用限制性內(nèi)切酶對目標DNA上的限制性內(nèi)切酶識別位點進行切割，從而形成小片段。
常用方法：使用機械法（例如超聲波DNA破碎）使大分子DNA形成在一定長度范圍內(nèi)分布的短序列片段。

二、代測序的背景和特點
1.2005年，羅氏推出了第一款二代測序儀羅氏454，生命科學開始進入高通量測序時代。
2.隨著Illumina系列測序平臺的推出，極大降低了二代測序的價格，推動了高通量測序在生命科學各個研究領(lǐng)域的普及。
3.特點：通量高、讀長短

三、NGS實驗步驟
1.核酸提取與檢測
2.文庫構(gòu)建與文庫檢測
3.上機測序

原理：
從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。利用DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L的NaCl溶液這一性質(zhì)可以將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品破碎細胞液中分開。分離得到核蛋白后，還需進一步將蛋白等雜質(zhì)除去。
去除蛋白的方法有3種：
①用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)。用這種方法處理時，蛋白質(zhì)停留在水相和氯仿相中間，而DNA則溶于上層水相，用兩倍體積95%乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉淀出來。
②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，從而使其與核酸分離，也可從材料中直接提取出DNA。
③用苯酚處理，然后離心分層，一樣可以將DNA+與蛋白質(zhì)分離開來。這時DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)，吸出上層水相，加入兩倍體積的95%乙醇即可得到白色纖維狀DNA沉淀。反復使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的DNA制品。

磁珠吸附法、過柱收集法DNA提取步驟
?細胞裂解
?去除雜質(zhì)
?回收DNA
?清洗溶解DNA

2.文庫構(gòu)建與文庫檢測
NGS文庫構(gòu)建：DNA片段加接頭修飾的過程。
以試劑盒NEBNext?Ultra?II DNA Library Prep Kit for Illumina?為例

具體步驟：
①末端修飾：
1.使用Tap聚合酶補齊不平的末端
2.并在兩個末端添加突出的堿基A，從而產(chǎn)生粘性末端（若使用Tap酶擴增，則無需末端修飾）
3.產(chǎn)生粘性末端的片段可以添加接頭（Adaptor）

②添加接頭：
1.經(jīng)過末端修飾后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接頭具有突出的T尾，可以使用連接酶將接頭添加到DNA片段兩端。
2.NEB的接頭為特殊的堿基U鏈接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（可以增強穩(wěn)定性），因此連接接頭后，還需要將堿基U刪除從而形成"Y"型接頭。
3.上一步添加的接頭主要是為了后續(xù)PCR中作為引物擴增繼續(xù)添加文庫index和與測序平臺互補的寡核苷酸序列（此外還作為測序引物Rd1 SP/Rd2 SP）.
4.之所以為"Y"型開叉結(jié)構(gòu)，是因為每一端接頭是兩條不互補的序列（每一端都是Rd1 SP與Rd2 SP交錯），連接酶沒有選擇性，每個接頭都是只靠突出來的T與DNA鏈接，"Y"接頭保證了每條單序列均為不同的測序引物，從而在后續(xù)PCR中可以連接不同的管核苷酸序列（P5/P7）。

③磁珠純化：
添加接頭后的文庫體系中含有聚合酶、連接酶等各種酶以及輔助物質(zhì)，接頭的添加也是過量的，而且由于末端的不穩(wěn)定性，容易形成自連片段，鳥槍法打斷的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）純化來去除大片段以及各種雜志，從而獲得成功添加接頭的文庫片段。
1.原理：磁珠可以通過氫鍵等作用力來吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小選擇的能力，但其儲存的buffer里面還有20%的PEG 8000，PEG濃度越大則可以吸附的DNA片段越小。
2.注意事項：磁珠純化的時候要根據(jù)文庫片段不同嚴格控制磁珠添加量（實際上就是PEG添加量）來實現(xiàn)片段選擇。

④PCR擴增：
1.添加了接頭的DNA片段，可以使用與接頭互補的引物來擴增。
2.片段還需要添加用于區(qū)分不同文庫的特異性index，以及與測序儀芯片互補的兩種寡核苷酸序列（P5/P7）。

⑤第二次磁珠純化：
1.PCR后需要將產(chǎn)物DNA片段與聚合酶等雜質(zhì)分離，因此再次進行磁珠純化。
2.之后進行質(zhì)量檢測，包括DNA濃度檢測、瓊脂糖凝膠電泳和片段長度檢測，完成建庫。