在科技日新月異的今天，NGS（Next-Generation Sequencing，二代測序）技術(shù)以其高通量、高效率和高準(zhǔn)確性的特點，在生物醫(yī)學(xué)研究中占據(jù)了舉足輕重的地位。作為一項前沿的基因測序技術(shù)，NGS不僅極大地推動了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，還為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供了強有力的支持。

NGS實驗流程

一、DNA提取及質(zhì)檢
1、樣本準(zhǔn)備：從血漿、新鮮組織等多種來源獲取純凈、足量且質(zhì)量良好的樣本DNA。
2、DNA提取：使用適當(dāng)?shù)奶崛》椒?，如酚氯仿抽提法、磁珠法等，提取樣本中的DNA。
3、質(zhì)檢：通過電泳、分光光度計等方法檢測DNA的濃度、純度和完整性，確保DNA質(zhì)量滿足后續(xù)實驗要求。

二、文庫構(gòu)建
1、DNA處理：將DNA打斷成適合測序儀讀取的長度區(qū)間（如200-300bp），并進行末端修復(fù)、片段篩選等處理。
2、加接頭：在DNA片段的兩端加上特定的接頭序列，這些接頭序列含有測序引物的結(jié)合位點，用于后續(xù)的測序反應(yīng)。
3、PCR擴增：以接頭序列為模板，通過PCR擴增得到足夠數(shù)量的DNA文庫。

三、靶向捕獲（可選）
對于特定區(qū)域的測序項目（如全外顯子組測序、基因組特定區(qū)域測序等），需要使用靶向捕獲技術(shù)從文庫中高效地富集目標(biāo)序列。這一步驟可以提高測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和深度，有助于更具針對性地分析感興趣的基因或區(qū)域。

四、上機測序
1、文庫加載：將經(jīng)過準(zhǔn)備的文庫加載到測序儀的流動池中，為后續(xù)測序提供必要的樣本。
2、測序反應(yīng)：測序儀利用邊合成邊測序或邊連接邊測序的方法對文庫中的核酸片段進行測序。在測序過程中，測序儀會逐步引入帶有熒光標(biāo)記的dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸），并通過監(jiān)測熒光信號來確定每個位置的堿基類型。
3、圖像捕獲與數(shù)據(jù)分析：使用高分辨率攝像機捕獲熒光信號的圖像，然后通過生物信息學(xué)軟件對圖像和測序數(shù)據(jù)進行處理和分析，得到完整的測序結(jié)果。

五、數(shù)據(jù)分析
1、初級分析：將光強數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為序列信息（AGCT），即原始的測序數(shù)據(jù)。
2、二級分析：多由儀器自動完成，包括堿基質(zhì)量評分、序列比對、變異檢測等步驟。
3、三級分析：涉及對vcf文件的處理，可進行個性化調(diào)整，如基因注釋、變異過濾等，以得到最終的測序結(jié)果和生物學(xué)意義。

六、結(jié)果解讀與報告
根據(jù)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，解讀測序數(shù)據(jù)中的變異信息，如單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入或刪除（InDel）、結(jié)構(gòu)變異等，并結(jié)合相關(guān)的數(shù)據(jù)庫和文獻信息，提供生物學(xué)意義的解釋和報告。

NGS實驗流程是一個復(fù)雜而精細的過程，它涵蓋了從DNA提取、文庫構(gòu)建、靶向捕獲（可選）、上機測序到數(shù)據(jù)分析等多個環(huán)節(jié)。每一步驟都至關(guān)重要，需要嚴(yán)格的技術(shù)操作和質(zhì)量控制，以確保測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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