Bradford 法是一種比色法（依靠顏色變化）蛋白質(zhì)定量方法。該方法的核心是 Coomassie 亮藍(lán) G-250 染料。這種染料在未結(jié)合狀態(tài)下呈紅褐色，在 465 nm波長處吸收光。然而，當(dāng)它主要通過精氨酸和賴氨酸殘基與蛋白質(zhì)結(jié)合時，染料的顏色會變?yōu)樗{(lán)色，最大吸光度也會變?yōu)?595 nm。這種顏色和吸光度的變化與蛋白質(zhì)濃度成正比，可用于定量。

需要 Bradford 法的工作流程

蛋白質(zhì)純化

在每個純化步驟后，確定純化蛋白的濃度對于評估產(chǎn)量和純度至關(guān)重要。Bradford法提供了一種快速可靠的蛋白質(zhì)定量方法，幫助研究人員判斷哪些組分需要合并，并有助于評估純化過程的效率和成功率。

細(xì)胞裂解物制備

在將裂解液用于下游應(yīng)用之前，了解其蛋白質(zhì)濃度至關(guān)重要。這可以確保在不同樣品中使用等量的蛋白質(zhì)，從而得到一致且可比較的結(jié)果。Bradford法通常用于確定這些裂解液中的總蛋白含量。

SDS-PAGE 樣品制備

為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，SDS-PAGE 凝膠中的每個孔都必須含有等量的蛋白質(zhì)。這可確保在比較各泳道的條帶時，觀察到的任何差異都是由于實(shí)驗(yàn)條件而非負(fù)載量不均造成的。Bradford法可用于調(diào)整樣品的蛋白質(zhì)濃度，使每個孔中的蛋白質(zhì)含量相等。

Bradford 檢測方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

這是最常見的方法，包括使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（通常是牛血清白蛋白 (BSA) 或γ 球蛋白）繪制校準(zhǔn)曲線。

1. 準(zhǔn)備一系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)稀釋液，以覆蓋樣品中蛋白質(zhì)濃度的預(yù)期范圍。
2. 在每個標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中加入Bradford試劑并孵育一小段時間（通常為 5-10 分鐘）。
3. 使用分光光度計(jì)在 595 nm波長處測量每個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。
4. 將吸光度值與已知蛋白質(zhì)濃度相對照，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5. 測量未知樣品的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其蛋白質(zhì)濃度。

單點(diǎn)法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的快速替代方法。它是利用單一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)來估計(jì)未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1. 制備濃度在樣品預(yù)期范圍內(nèi)的單一標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
2. 在標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品中加入Bradford試劑。
3. 測量標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品的吸光度。
4. 利用吸光度與已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度的比值計(jì)算未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

微孔板法

該方法將 Bradford 法改良為使用微孔板進(jìn)行高通量分析，可同時測定多個樣品。

1. 將標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品移入微孔板的孔中。
2. 在每個孔中加入 Bradford 試劑。
3. 培養(yǎng)所需時間。
4. 使用微孔板閱讀器在 595 nm波長處測量各孔的吸光度。
5. 如果在微孔板格式中使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，則將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值與其已知濃度相對照，生成校準(zhǔn)曲線。利用此曲線確定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

與手動移液相比，自動化 Bradford 法的優(yōu)勢：

• 一致性和可重復(fù)性： 自動化可減少人為誤差，使結(jié)果更加一致。
• 高通量： 自動化系統(tǒng)可同時處理多個樣本，提高了效率。
• 降低污染風(fēng)險(xiǎn)： 自動化最大程度地降低了樣本間交叉污染的幾率。
• 數(shù)據(jù)記錄： 自動化系統(tǒng)通常配有記錄數(shù)據(jù)的軟件，從而更容易跟蹤和分析結(jié)果。