ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是一種常用于生物醫(yī)學(xué)研究中的實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于抗體、抗原、激素、病毒等的檢測(cè)。通過(guò)ELISA檢測(cè)，科研人員可以獲得定量或定性的分析結(jié)果，這使得它在臨床診斷、疾病監(jiān)測(cè)以及藥物研發(fā)中有著不可替代的作用。

ELISA檢測(cè)

一、包被階段
ELISA檢測(cè)的首要步驟是將待測(cè)的首要成分固定于包被板上。這一過(guò)程主要通過(guò)被動(dòng)吸附實(shí)現(xiàn)，其效果取決于包被物質(zhì)的性質(zhì)。若樣品中含多種抗原，則需選用具有選擇性的包被板，以避免非特異性結(jié)合。然而，在間接ELISA法檢測(cè)抗體時(shí)，使用純化抗原；或在夾心ELISA法中，使用捕獲抗體時(shí)，包被板已具備選擇性。包被板材質(zhì)多為聚苯乙烯或其衍生物，其結(jié)合特性因目標(biāo)物質(zhì)及檢測(cè)需求而異。對(duì)于某些難以吸附的物質(zhì)，如高度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物等，建議使用允許共價(jià)連接的特殊處理包被板。

二、孵育階段
試劑加入包被板后，需進(jìn)行孵育，以促進(jìn)結(jié)合或反應(yīng)。孵育的溫度和時(shí)間依據(jù)檢測(cè)步驟及操作而異。通常，樣品應(yīng)用后于37℃孵育1小時(shí)。然而，某些步驟，如阻斷，可在冰箱中過(guò)夜進(jìn)行；而測(cè)定過(guò)程中的孵育則通常在室溫下短時(shí)間進(jìn)行。

三、洗滌階段
洗滌是ELISA檢測(cè)中至關(guān)重要的步驟，需在每次應(yīng)用檢測(cè)成分后進(jìn)行，直至結(jié)果測(cè)定。洗滌時(shí)，通常使用磷酸鹽緩沖鹽水-20（PBST）作為緩沖液，以去除未結(jié)合的抗原、抗體或試劑。洗滌可手工使用多通道移液器完成，也可使用自動(dòng)洗板機(jī)。洗滌不充分可能導(dǎo)致高背景信號(hào)，而過(guò)度洗滌則可能導(dǎo)致樣品信號(hào)降低。洗滌的一致性對(duì)于確保板塊結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。

四、阻斷階段
在蛋白質(zhì)包被ELISA板后，通常需進(jìn)行阻斷，以防止后續(xù)步驟中抗體的非特異性結(jié)合。阻斷時(shí)，向板中加入與檢測(cè)無(wú)關(guān)的混合蛋白并進(jìn)行孵育，以占據(jù)非特異性結(jié)合位點(diǎn)。常用的阻斷緩沖液包括脫脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。此外，非離子洗滌劑如Tween 20或Triton X-100也可作為阻斷劑使用，但其阻斷效果不如蛋白質(zhì)持久。無(wú)效的阻斷會(huì)導(dǎo)致背景噪音增加，降低檢測(cè)的靈敏度和特異性。

五、抗體階段
抗體是ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵組成部分，選擇合適的抗體至關(guān)重要。單克隆抗體和多克隆抗體均可使用，各有優(yōu)缺點(diǎn)。單克隆抗體具有高特異性，但成本較高；而多克隆抗體則能在多個(gè)結(jié)合點(diǎn)與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合，從而放大信號(hào)并提高靈敏度。使用二級(jí)抗體雖增加了步驟和檢測(cè)時(shí)間，但可能帶來(lái)靈敏度的提高。因此，在優(yōu)化檢測(cè)時(shí)，需找到合適的抗體對(duì)。

六、測(cè)定階段
無(wú)論采用何種類(lèi)型的ELISA檢測(cè)，最后一步均為測(cè)定。最常用的測(cè)定方法是利用酶介導(dǎo)的可見(jiàn)顏色變化化學(xué)反應(yīng)，隨后通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行測(cè)量。酶結(jié)合抗原或抗體被添加到測(cè)試孔中，若目標(biāo)物質(zhì)存在，則與其結(jié)合。當(dāng)加入適當(dāng)?shù)孜飼r(shí)，酶會(huì)引發(fā)顏色變化，其程度與目標(biāo)物質(zhì)的數(shù)量成正比。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是常用的共軛物之一，通常與底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）配合使用。在HRP的作用下，TMB由藍(lán)色變?yōu)辄S色，隨后加入硫酸溶液終止反應(yīng)。最后，使用酶標(biāo)儀在450nm波段測(cè)定每個(gè)孔的吸光度值，并根據(jù)檢測(cè)設(shè)計(jì)進(jìn)行校正和計(jì)算，如減去空白孔平均值、技術(shù)重復(fù)平均值或與標(biāo)準(zhǔn)比率計(jì)算。

ELISA檢測(cè)是一個(gè)復(fù)雜但非常重要的實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于各類(lèi)醫(yī)學(xué)研究和診斷。通過(guò)對(duì)ELISA檢測(cè)流程的理解和掌握，科研人員可以準(zhǔn)確、快速地獲取相關(guān)數(shù)據(jù)，為疾病的早期診斷、藥物的研發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。

相關(guān)閱讀推薦

Opentrons Flex 轉(zhuǎn)板抓手

自動(dòng)化帶來(lái)更佳生物實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的 3 種方法

自動(dòng)化 NGS 工作流程的 5 個(gè)理由

全自動(dòng)移液工作站在機(jī)器人技術(shù)上的體現(xiàn)

全自動(dòng)移液工作站適用于哪些毒性測(cè)試項(xiàng)目？

PCR全自動(dòng)移液工作站怎么實(shí)現(xiàn)分區(qū)處理