作者
馬修·阿卡納，金納里·沃森博士，莫拉約·阿德伊比博士。

介紹
下一代測(cè)序（NGS）的工作流程包括使用市售軟件制備DNA文庫(kù)以及經(jīng)濟(jì)有效的DNA制備試劑盒。通過使用自動(dòng)化的OT-2協(xié)議來優(yōu)化這個(gè)工作流很有幫助以提高DNA文庫(kù)的制備效率。
在這里，我們描述了伊利?DNA的效率。準(zhǔn)備工具包(Illumina，CatNo。20018705)在OT-2，機(jī)器人液體處理平臺(tái)上，自動(dòng)執(zhí)行標(biāo)記工作流程。使用OT-2的高性能能力自動(dòng)化此過程提供了一個(gè)快速和健壯的工作流程，生成用于基因組測(cè)序的統(tǒng)一DNA準(zhǔn)備文庫(kù)。

照明?DNA準(zhǔn)備試劑盒和外中心OT-2平臺(tái)概述
伊利?專利NGS標(biāo)記工作流程實(shí)現(xiàn)了利用珠子進(jìn)行的珠上標(biāo)記鏈接的轉(zhuǎn)座體。珠鏈的化學(xué)性質(zhì)轉(zhuǎn)座體對(duì)DNA片段化更有效和DNA末端修復(fù)與之前的溶液內(nèi)標(biāo)記工作流程相比。該DNA片段使用雙索引適配器進(jìn)行標(biāo)記，這是一種獨(dú)特的條形碼分配每個(gè)DNA片段。DNA Prep樣本（n=8）分別為量化，歸一化到一個(gè)4nM的庫(kù)，匯集到一個(gè)單個(gè)多路復(fù)（8倍或16倍）樣品，然后在Illumina?MiSeq上的2x75流細(xì)胞上進(jìn)行基因組測(cè)序。我們的數(shù)據(jù)顯示了所有數(shù)據(jù)的低可變性，PNA擴(kuò)增前后測(cè)定的DNA制備樣本；條形碼平衡，以及統(tǒng)一和高覆蓋率的測(cè)序比對(duì)。參考基因組的研究表明，使用OT-2協(xié)議的自動(dòng)標(biāo)記為基因組測(cè)序提供了一個(gè)高質(zhì)量的DNA準(zhǔn)備文庫(kù)。

OT-2工作流協(xié)議的原理圖
DNA和IDT?對(duì)?DNA/RNA UD指數(shù)集A的DNA和IDT?。20027213)在孵育期間一個(gè)被稱為標(biāo)記的過程，在OT-2上，如圖（圖1）所示。進(jìn)行了標(biāo)記清洗步驟，以去除殘留的DNA和適配器。下一個(gè)的用OT-2方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增具有可編程蓋和塊溫度的甲板上熱循環(huán)器。

按照OT-2方案，進(jìn)行后擴(kuò)增
使用AMPure(貝克曼庫(kù)爾特，貓。不a63881)根據(jù)制造商進(jìn)行檢測(cè)推薦DNA Prep樣本被定量，歸一化至4nM(使用NEBNext?文庫(kù)定量試劑盒對(duì)伊利?文庫(kù)定量進(jìn)行qPCR測(cè)定試劑盒，以8倍或16倍的形式匯集成單個(gè)樣本，然后在伊利?MiSeq上的2x75流池上運(yùn)行。根據(jù)伊利?DNA/RNA獨(dú)特雙（UD）索引適配器條形碼序列，提取測(cè)序數(shù)據(jù)并進(jìn)行解復(fù)用。與參考基因組和覆蓋圖譜對(duì)齊的序列是通過真真品2021.2.2

工作流布局
OT-2平臺(tái)的布局包括模塊，實(shí)驗(yàn)室軟件，和伊利米納?DNA準(zhǔn)備試劑，如詳見（圖2）。雖然該工作流包括：在OT-2上進(jìn)行自動(dòng)移液，人工干預(yù)是需要在甲板上的之間移動(dòng)樣品板熱循環(huán)筆和磁塊，并在協(xié)議期間重置移液管尖端架。

DNA制備樣本的PCR擴(kuò)增
采用伊利?DNA制備試劑盒構(gòu)建OT-2上的Lambda DNA文庫(kù)（n=8,100 ng）。分別定量前后PCR濃度（ng/uL）5個(gè)周期的PCR擴(kuò)增，和DNA濃度使用Quant-iT?dsDNA高靈敏度檢測(cè)試劑盒(熱費(fèi)雪科學(xué)公司，Cat。No.Q33120)在一個(gè)Qubit?上確定變異系數(shù)，即標(biāo)準(zhǔn)差除以整個(gè)樣本的平均值。Lambda DNA樣本的PCR前平均濃度為2.92，變異系數(shù)（CV）為10.4%，5個(gè)周期后的PCR后濃度平均為28.23，CV為10.7%，見（表1）。這些結(jié)果很簡(jiǎn)單，優(yōu)化后的OT-2協(xié)議可以產(chǎn)生一個(gè)高質(zhì)量和可靠的NGS DNA準(zhǔn)備庫(kù)。

DNA制備文庫(kù)的小基因組測(cè)序
對(duì)96個(gè)樣本的?DNA制備試劑盒(M)進(jìn)行標(biāo)記。用No. 20018705)制備了大腸桿菌非甲基化基因組DNA (Zymogen，Cat。. 不. 樣品（n=16,100ng）

這個(gè)工作流在OT-2上都有自動(dòng)的移液功能，需要手動(dòng)操作在甲板上移動(dòng)樣品板(1)和磁性磁塊(2)，以及復(fù)位在運(yùn)行期間的尖端機(jī)架。甲板布局包括1個(gè)NEST 12井水庫(kù)，1個(gè)96井鋁塊，1倍埃彭多夫熱循環(huán)器上的200ul PCR板，和一個(gè)1xNEST0.1 mL PCR板上溫度模塊(3)。模塊包括一個(gè)磁性模塊、溫度模塊、熱循環(huán)器模塊，以及P20和P300多通道移液管。

兩批，第二批，E。. 大腸桿菌DNA樣本
（n=8,100 ng）在OT-2上的2個(gè)單獨(dú)的列上進(jìn)行處理，以解釋列內(nèi)可能出現(xiàn)的可變性。
E. 大腸桿菌DNA（n=16,100 ng）和Lambda DNA (n=8,100ng)被擴(kuò)增、歸一化，并匯集到一個(gè)單一的多路復(fù)用（8倍或16倍）樣本中進(jìn)行測(cè)序。
對(duì)三個(gè)DNA制備批次的測(cè)序結(jié)果為比較確定樣品產(chǎn)量，條形碼
. 平衡和覆蓋率，如（表2）所示，對(duì)DNA制備文庫(kù)觀察到統(tǒng)一的產(chǎn)量。計(jì)算了E的樣本產(chǎn)量。8號(hào)試驗(yàn)室的大腸桿菌含量分別為9.75和3.79
. 16倍；8倍和16倍?適配器條碼的CV值分別為8.77%和6.2%，顯示8倍和16倍樣本的平衡是準(zhǔn)確的8倍的平均11.2%-12.31%，相比之下，預(yù)期的為12.5%。對(duì)于16-plex，根據(jù)伊利?參考計(jì)算的6%的期望值為6.2%。DNA的平均基因組覆蓋率準(zhǔn)備了E。大腸桿菌樣本的8倍為150倍，16倍為45倍
. 此外，Lambda 48kb基因組的覆蓋圖譜顯示~為7800倍，這表明對(duì)齊的序列reads水平較高（圖3）?？偟膩碚f，這表明在OT-2上構(gòu)建的用于測(cè)序的DNA Prep文庫(kù)與參考計(jì)算相比顯示出一致性（圖4）。

結(jié)論
我們演示了它的高性能和性能。在視中心OT-2上使用伊利umina?DNA準(zhǔn)備試劑盒自動(dòng)標(biāo)記過程。我們展示了DNA Prep樣本顯示出低變異性，條形碼平衡性，以及序列比對(duì)的高覆蓋率。自動(dòng)化這個(gè)全面的NGS工作流在的上OT-2將DNA文庫(kù)制備過程中的風(fēng)險(xiǎn)降至最低，同時(shí)確保基因組的DNA文庫(kù)制備質(zhì)量先后順序