背景

已經(jīng)評估了兩種用于從鼻咽拭子中高通量提取 RNA 以檢測 SARS-CoV-2 的自動化內(nèi)部協(xié)議。

方法

在 10 天內(nèi)收集了 141 個 SARS-CoV-2 陽性樣本。內(nèi)部協(xié)議基于磁珠提取，設計用于 Opentrons OT-2（OT-2_內(nèi)部）液體處理機器人或 MagMAX ^TM Express-96 系統(tǒng)（MM_{內(nèi)部）。兩種協(xié)議均與使用 MagMAX} ^TM系統(tǒng)（MM_試劑盒）的商業(yè)試劑盒并行測試。核酸提取效率是根據(jù) SARS-CoV-2 DNA 陽性對照計算的。

結果

在檢測陽性樣本方面，內(nèi)部方案和商用試劑盒之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。MM 試劑_盒效率最高，盡管_{內(nèi)部 MM 試劑盒}的平均 Ct 值低于其他兩種試劑盒。與商用試劑盒相比，內(nèi)部方案每提取 96 個樣本可節(jié)省 350 歐元至 400 歐元。

結論

所述協(xié)議利用易于獲得的試劑和開源液體處理系統(tǒng)，適用于高通量設施中的 SARS-CoV-2 檢測。

引用： Lázaro-Perona F、Rodriguez-Antolín C、Alguacil-Guillén M、Gutiérrez-Arroyo A、Mingorance J、García-Rodriguez J 等人。 （2021）評估兩種用于 SARS-CoV-2 檢測的自動化低成本 RNA 提取方案。 PLoS ONE 16(2): e0246302。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246302

編輯： AM Abd El-Aty，埃及開羅大學

收稿日期： 2020 年 11 月 5 日；接受日期： 2021 年 1 月 15 日；發(fā)表日期： 2021 年 2 月 16 日

版權所有：?? 2021 Lázaro-Perona 等人。這是一篇開放獲取的文章，根據(jù)知識共享署名許可條款分發(fā)，允許在任何媒體中不受限制地使用、分發(fā)和復制，前提是注明原作者和出處。

數(shù)據(jù)可用性：所有相關數(shù)據(jù)均在論文及其支持信息文件中。

資金：作者未收到此項工作的特定資金資助。

競爭利益：作者已聲明不存在競爭利益。

介紹

SARS-CoV-2 疫情要求大規(guī)模使用 qPCR 檢測，以發(fā)現(xiàn)陽性病例并追蹤接觸者，從而阻止社區(qū)傳播。在 qPCR 檢測之前，通常需要對臨床樣本進行 RNA 提取 [?1-4?]?？紤]到每天檢測的樣本數(shù)量，大多數(shù)機構無法采用手動 RNA 提取方法，因此，自動化系統(tǒng)被廣泛用于此任務 [?5-7?] 。自動化系統(tǒng)的缺點是，它顯著增加了最終成本，這可能會阻礙某些地區(qū)的大規(guī)模檢測。此外，由于需求增加，提取試劑的庫存短缺導致診斷嚴重延遲。

本文介紹了兩種低成本的自動 RNA 提取方法。第一種方法使用 OT-2 系統(tǒng)（Opentrons，紐約州紐約市，美國），這是一種能夠自動執(zhí)行自行設計方案的開源液體處理機器人；第二種方法使用快速且易于使用的核酸提取儀 MagMAX ^TM Express-96 系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，馬薩諸塞州沃爾瑟姆，美國）。后者可在 30 分鐘內(nèi)提取多達 96 個樣本，但需要事先手動分配試劑、磁珠和 96 孔板中的樣本，這會增加 30 分鐘。作為替代方案，OT-2_內(nèi)部方案可以完全自動化地在 104 分鐘內(nèi)處理多達 48 個樣本。

方法

樣品采集

在十天內(nèi)，收集了 141 份連續(xù)的 SARS-CoV-2 陽性鼻咽拭子，這些拭子帶有病毒運輸培養(yǎng)基（西班牙巴塞羅那 Deltalab），并儲存在 4°C 下。處理前，將 500 μL 病毒培養(yǎng)基和 500 μL 4M 異硫氰酸胍 (GTC)（德國希爾登 Qiagen）與 5 μg/mL 載體 RNA 混合，使樣品失活，然后將樣品在 80°C 下加熱 2 分鐘，并短暫渦旋混合。

設備和試劑

核酸自動提取采用兩種系統(tǒng)：MagMAX ^TM Express-96 深孔磁粉處理器（King Fisher Instrument，Thermo Fisher Scientific，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）和開放式系統(tǒng) OT-2（Opentrons，美國紐約州紐約），配有 GEN1 磁模塊（Opentrons，美國紐約州紐約）和內(nèi)部協(xié)議。兩種系統(tǒng)均使用 MagMAX? Express 96 板和深孔板（Thermo Fisher Scientific，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。

核酸提取采用三種方法：1）根據(jù)制造商的說明，使用 MagMAX?^TM和商用 MagMAX CORE 核酸純化試劑盒 (MM_{試劑盒)（Thermo Fisher Scientific，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）；2）OT-2 系統(tǒng)采用通用試劑（OT-2內(nèi)部}），例如乙醇（Emsure?，Merck KGaA，德國達姆施塔特）、2-丙醇（Emsure?，Merck KGaA，德國達姆施塔特）、洗脫緩沖液（Omega BIO-TEK，美國佐治亞州諾克羅斯）、無核酸酶水（Ambion?^TM，Thermo Fisher Scientific，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）和磁珠（Mag-Bind? TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國佐治亞州諾克羅斯）；3）MagMAX?^TM采用與商用試劑盒相同的協(xié)議，但使用 OT-2 方法中的試劑（MM_內(nèi)部）。內(nèi)部協(xié)議是 Hui He 等人描述的程序的修改版[8]。簡而言之，將滅活的呼吸道樣本以 1:1 的比例與異丙醇混合，至最終體積為 500 μl（_{內(nèi)部OT-2）和 1000 μL（內(nèi)部}MM），加入 40 μL 磁珠并在室溫下孵育 5 分鐘。接下來，用磁鐵將磁珠拉到管的一側并棄去上清液。然后用 500 μL 新鮮制備的 70% 乙醇洗滌磁珠兩次。第二次洗滌后，棄去 70% 乙醇并在室溫下風干磁珠。最后，將珠子重新懸浮在 100 μL 洗脫緩沖液中并再次用磁鐵分離以回收洗脫的病毒 RNA（表1）。

表 1.所評估的三個方案中使用的步驟、試劑和體積（μL）。

協(xié)議設計和驗證

MM_試劑盒協(xié)議：

1. 準備兩個深孔板，一個深孔板每孔裝有 500μL MagMAX? CORE Wash Solution 1，另一個深孔板每孔裝有 500μL MagMAX? CORE Wash Solution 2。準備一個 MagMAX? Express 96 微量滴定板，每個孔裝有 90μL MagMAX? CORE Elution Buffer。
2. 每個樣品準備 20μL MagMAX? CORE 磁珠和 10μL MagMAX? CORE 蛋白酶 K 的混合物（珠子/PK 混合物）。
3. 為每個樣品準備 300μL MagMAX? CORE 裂解溶液和 300μL MagMAX? CORE 結合溶液的混合物（裂解/結合溶液）。
4. 在深孔板中每孔分配 30μL 珠子/PK 混合物、700μL 裂解/結合溶液和 200μL 樣品。
5. 將所有板放入系統(tǒng)并運行腳本 MagMAX_CORE_KF-96。

MM_內(nèi)部協(xié)議：

1. 準備兩個深孔板，每個孔加入 500μL 70% 乙醇。準備一個 MagMAX? Express 96 微量滴定板，每個孔加入 90μL 洗脫緩沖液（Omega BIO-TEK，美國佐治亞州諾克羅斯）。
2. 在深孔板中每孔分配 40 μL 磁珠（Mag-Bind? TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國佐治亞州諾克羅斯）、500 μL 異丙醇和 500 μL 樣品。
3. 將所有板放入系統(tǒng)并運行腳本 MagMAX_CORE_KF-96。

OT-2_內(nèi)部協(xié)議：

1. 將 40μL 磁珠（Mag-Bind? TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國佐治亞州諾克羅斯）、250μL 異丙醇和 250μL 樣品分裝到深孔板中。用移液器吹打五次混勻，室溫下孵育 5 分鐘。
2. 激活GEN1磁性模塊4分鐘。
3. 收集上清液并棄去。
4. 加入500μL 70%乙醇，收集并丟棄。
5. 加入500μL 70%乙醇，收集并丟棄。
6. 風干 4 分鐘。
7. 關閉GEN1磁性模塊并添加100μL洗脫緩沖液（Omega BIO-TEK，美國佐治亞州諾克羅斯）。
8. 30秒后打開GEN1磁性模塊。
9. 90秒后收集上清液并轉移至96孔微量滴定板。

樣品輸入量是自動移液系統(tǒng)允許的最大量，其他試劑的量也不同，因此三種方法的輸入量不同

OT-2內(nèi)部協(xié)議是根據(jù) Opentrons 說明用 Python 編寫的。腳本已存放在 GitHub 存儲庫中

為了驗證內(nèi)部核酸提取方案的性能，使用 DNA 陽性對照 TaqMan 2019-nCoV 對照試劑盒 v1（賽默飛世爾科技，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）制作了標準、低和極低病毒載量的模擬樣本。對照試劑盒的濃度為 1 x 10 ⁴拷貝/μL。標準病毒載量樣本的制備方法是將 10 μL 陽性對照與 490 μL 病毒運輸培養(yǎng)基和 500 μL GTC 混合。低和極低病毒載量的制備方式相同，但使用陽性對照的十倍連續(xù)稀釋液。所有模擬樣本均制備三份，并與_內(nèi)部OT-2 、MM_{試劑盒和內(nèi)部}MM并行處理，然后使用 TaqMan 2019-nCoV 檢測試劑盒 v1 進行 qPCR 測試。標準、低和極低病毒載量的模擬樣本中陽性對照的最終濃度分別為 1 x 10 ⁶拷貝/mL、1 x 10 ⁵拷貝/mL 和 1 x 10 ⁴拷貝/mL。所有運行均包括陰性對照。

通過將模擬樣本中陽性對照的 Ct 值 (Ct _ss ) 與直接從庫存制備的陽性對照的 Ct 值進行比較來計算核酸提取效率，校正量以匹配稀釋因子和每個方案中使用的初始樣本量 (Ct _pc ) (R = 2 ^-ΔCt = 2 ^-(Ctss-Ctpc) )。

定量PCR

使用針對orf1ab、刺突 (S)、核衣殼 (N) 和人 RNaseP 基因的 TaqMan 2019-nCoV 檢測試劑盒 v1 以及作為陽性對照的 TaqMan 2019-nCoV 對照試劑盒 v1，按照制造商推薦的 qPCR 條件對 SARS-CoV-2 病毒 RNA 進行核酸擴增。所有 qPCR 檢測均在 CFX96 Touch 實時 PCR 檢測系統(tǒng) (Bio-Rad，美國加利福尼亞州赫拉克勒斯) 中進行。為了減少檢測間差異，提取的核酸樣本使用另一個 OT-2 模塊自動分配到 qPCR 試紙中。

統(tǒng)計分析

成對比較了這三種方案。使用 McNemar 檢驗來比較它們將樣本分配為陽性或陰性的表現(xiàn)。Ct 值不呈正態(tài)分布，因此使用 Wilcoxon 符號秩檢驗來比較每個目標的 Ct 值。對于每個目標，僅考慮通過這三種方法擴增的樣本。使用 bootstrap 方法計算中位置信區(qū)間。

所有統(tǒng)計測試均采用 IBM SPSS Statistics 24.0.0.0 軟件包（SPSS Inc.，美國伊利諾伊州芝加哥）執(zhí)行。

結果

提取方案的效率

通過提取用模擬不同病毒載量的 SARS-CoV-2 陽性對照制備的模擬樣本，將兩種內(nèi)部方案的核酸提取效率與 MM_{試劑盒方案進行了比較。MM試劑盒}和 OT-2_內(nèi)部方案成功擴增了所有具有標準病毒載量的模擬樣本中的orf1ab、S 和 N 靶標。對于這些樣本，所有重復和基因的平均提取效率為 MM_{試劑盒33.9%（SD：13.8），OT-2內(nèi)部}方案19.6%（SD：2.2），MM_{內(nèi)部方案}16.0%（SD：5.03） 。

在低病毒載量模擬樣本中，MM_試劑盒無法擴增所有樣本中的 S 靶標，也無法擴增其中一個重復樣本中的 N 靶標，而 OT-2_內(nèi)部和 MM_內(nèi)部檢測出了所有基因。最后，MM_試劑盒和 OT-2_內(nèi)部方案無法擴增極低病毒載量樣本，除了一個重復樣本，其中 N 基因可以通過 OT-2_內(nèi)部方案擴增，但 MM_內(nèi)部可以檢測到所有樣本中的陽性對照，其中一個樣本含有三個靶標，一個樣本含有 orf1ab和N 靶標，最后一個樣本含有orf1ab靶標（S1 表）。

臨床呼吸道樣本的核酸提取

收集的 141 份陽性臨床樣本同時使用 MM_試劑盒、OT-2_內(nèi)部方法和 MM_內(nèi)部方法進行核酸提取，并通過 qPCR 檢測洗脫的 SARS-CoV-2 RNA。記錄每個目標的陽性/陰性結果和擴增循環(huán)閾值 (Ct)。根據(jù)制造商的說明，當三個目標區(qū)域中至少一個擴增且 Ct<40 時，樣本被視為陽性。所有運行中包括的陰性對照在所有情況下均產(chǎn)生陰性 PCR 結果。

141 個樣本中，123 個樣本通過至少一種提取方法檢測出 SARS-CoV-2 陽性，而 18 個樣本通過三種方法檢測均為陰性。這可能是由于樣本在采集期間降解所致，因為它們已在 4°C 下儲存了約 48 小時 [9]。按方法分類，114 個樣本使用 MM_{試劑盒檢測呈陽性，111 個樣本使用內(nèi)部}OT-2 檢測呈陽性，118 個樣本使用_內(nèi)部MM 檢測呈陽性。成對比較發(fā)現(xiàn)它們檢測 SARS-CoV-2 的性能沒有顯著差異（MM_試劑盒Vs OT-2_內(nèi)部，P =?0.5465；MM_試劑盒Vs MM_內(nèi)部，P =?0.3865；OT-2_內(nèi)部Vs MM_內(nèi)部，P =?0.0961）。18 個樣本通過三種方法中的一些方法檢測呈陰性。這些具有較高的 Ct 值，?orf1ab和 N 靶標的中值分別為 38.68 和 38.19（在這些樣本中，S 靶標未通過任何方法擴增）。比較所有方法和靶標的成對線性回歸和相關性分析顯示 R?²值在 0.85 和 0.95 之間，Bland-Altman 分析表明在整個 Ct 范圍內(nèi)一致性是一致的（S1 圖）。

_{在使用 MM試劑盒}提取的樣本中，43% 可檢測到三個靶標（orf1ab 、 N 和 S ），在使用_內(nèi)部OT-2 提取的樣本中，49%可檢測到，_{在使用內(nèi)部}MM 提取的樣本中，49% 可檢測到（圖 1）。在 34%、39% 和 30% 的樣本中檢測到了orf1ab和 N 靶標，在 19%、10% 和 17% 的樣本中僅擴增了 N 靶標。只有極少數(shù)樣本因單獨擴增orf1ab靶標（6）、orf1ab?+ S（1）或 N + S（5）靶標而被視為陽性，并且沒有樣本以 S 基因作為唯一的陽性標記。事實上，該檢測中的 S 靶標明顯缺乏靈敏度，并且與診斷決策無關。使用 OT-2_內(nèi)部協(xié)議檢測到兩個或三個目標的樣本占 87%（97 個樣本），使用 MM_{內(nèi)部協(xié)議檢測到兩個或三個目標的樣本占 82%（95 個樣本），使用 MM試劑盒}檢測到兩個或三個目標的樣本占 79%?（90 個樣本）。

考慮配對樣本時，在 orf1ab ( P = 0.437)、N ( P = 0.686) 和 S ( P = 0.794) 靶標的 Ct 值中，MM 試劑盒和 OT-2 內(nèi)部方案之間的 Cts 沒有顯著差異( 圖 2 )。與 MM 試劑盒 ( orf1ab?;?P?<?0.00001?,?N?;?_P?<?_0.00001?,?S?;?P?=?0.00148?)和OT?-?2內(nèi)部_方案(?orf1ab?;?P?<?0.00001, N;?P =?0.00008, S;?P =?0.00252)相比，MM_{內(nèi)部方案在所有靶標中的 Cts 確實顯}著較低。

圖 2.箱線圖顯示使用 MM_試劑盒、OT-2_內(nèi)部方法和 MM_{內(nèi)部方法獲得的}orf1ab?、S 和 N 目標的 Ct 值分布。y 軸顯示擴增循環(huán) (Ct)。顯示每個數(shù)據(jù)集上的數(shù)據(jù)點數(shù)量。

使用 MM_試劑盒、OT-2_{內(nèi)部試劑盒}和 MM_{內(nèi)部試劑盒對}orf1ab靶標的中位擴增循環(huán) (CI:95%)分別為 35.53 (33.82–36.36)、35.58 (34.33–36.21) 和 34.8 (33.71–35.29)。對于 S 基因，中位擴增循環(huán) (CI:95%) 為 30.16 (28.56–33.08)、31.32 (29.22–32.88) 和 31.07 (29.36–32.90)；對于 N 靶標，中位擴增循環(huán) (CI:95%) 為 34.83 (33.93–35.97)、34.64 (33.42–35.29) 和 34.28 (33.52–35.10)。

開采成本和實際操作時間

_{使用 OT-2內(nèi)部}協(xié)議提取 96 個樣本的核酸，總成本為 107 歐元（試劑 37 歐元和實驗室器具 70 歐元），實際操作時間為 10 分鐘，提取時間為 3 個半小時（腳本每次運行處理 48 個樣本，因此必須完成兩次）。MM_內(nèi)部成本為 66 歐元（試劑 37 歐元和實驗室器具 29 歐元），MM 試劑_盒成本為 472 歐元（試劑 443 歐元和實驗室器具 29 歐元）。兩種協(xié)議的實際操作時間均為 40 分鐘，提取時間均為 30 分鐘。值得注意的是，雖然 96 個樣本的 OT-2 協(xié)議比 MM_內(nèi)部協(xié)議貴 40 歐元，但所需的初始投資明顯較低，OT-2 系統(tǒng)（包括模塊和移液器）約為 10,000 歐元，MagMAX ^TM系統(tǒng)約為 50,000 歐元。

討論

本文介紹了兩種低成本病毒 RNA 提取和臨床樣本 SARS-CoV-2 檢測方法，其性能與商用試劑盒相當。盡管內(nèi)部方案提取 DNA 對照的效率低于商用試劑盒，但在臨床樣本中，整體靈敏度并未受到影響，這可能是因為內(nèi)部方案使用更大的樣本起始量來彌補較低的效率。

設置 OT-2 系統(tǒng)進行 RNA 提取需要對沒有經(jīng)驗的團隊進行密集編程，但提供了一種經(jīng)濟高效的替代方案，能夠在一次運行中提取 48 個樣本。這項工作中使用的腳本已上傳到開放訪問軟件存儲庫 GitHub，在那里可以找到許多用于這些和類似應用程序的協(xié)議。這應該有助于其他工作人員避免或減少編程步驟。該協(xié)議幾乎不需要動手時間，并且使用容易獲得的試劑。此外，與其他提取系統(tǒng)相比，該設備所需的投資較低，使其適用于中低資源設施。MagMAX?^TM?Express-96 是一種快速、半自動設備，每次運行能夠提取 96 個樣本。MM_試劑盒提供用于滅活、裂解、洗滌和洗脫的試劑，可以以具有競爭力的成本用于不同的基質(zhì)和樣品類型。另一方面，MM_內(nèi)部協(xié)議利用該系統(tǒng)的半開放方法，用其他化學品替代商業(yè)解決方案，使其更具成本效益。在這兩種情況下，都必須手動準備深孔板、緩沖液和樣品，這會增加總提取時間和操作錯誤風險。這兩種內(nèi)部協(xié)議的主要缺點是，當處理粘稠樣品時，粘液、高粘性多糖、白細胞、紅細胞、血紅蛋白、蛋白酶和含有大量細胞核酸的細胞碎屑會阻礙 RNA 提取或抑制 PCR 反應 [?10-12?]?。為了部分克服這個問題，可以在提取前對樣品進行加熱和渦旋或離心，但這會增加動手時間和響應時間。當使用_內(nèi)部MM時，洗脫樣品在某些情況下可能含有痕量的磁珠，但這不會影響 RT-PCR 反應的性能。

在這三個系統(tǒng)中，陰性對照在所有情況下均為陰性，表明在這些系統(tǒng)中處理原始樣本時不存在交叉污染問題。不過，與非自動化系統(tǒng)一樣，應采取預防措施，將 PCR 前和 PCR 后操作分開。如果使用 OT-2 模塊設置 PCR 后反應（例如測序），則不應使用它從樣本中提取核酸，除非徹底凈化。

研究優(yōu)勢和局限性

這項研究的主要優(yōu)勢在于，這些方法都是在臨床微生物實驗室中用真實樣本進行測試的。方法之間的比較并不系統(tǒng)，這是一個重要的限制。事實上，設計的目的是優(yōu)化每個系統(tǒng)的結果，因此輸入是不同的。系統(tǒng)地探索輸入樣本量以及其他試劑量將是有益和有益的，但這超出了這項研究的目的，即比較臨床實驗室環(huán)境中系統(tǒng)與真實樣本的性能。

結論

總之，這里介紹的兩種內(nèi)部核酸提取方法可有效實現(xiàn) SARS-CoV-2 的高通量診斷，且成本僅為其他商業(yè)試劑盒的一小部分，且不損失靈敏度。