摘要
隨著生命科學屆對PCR的需求正在增加。在本應用說明中，我們展示了 Opentrons PCR 工作站與市面主流的外置第三方熱循環(huán)儀相 比，能夠生成預期的PCR擴增產(chǎn)物的堿基對長度。結果顯示，無論是嵌套PCR還是多重PCR, 都能產(chǎn)生預期的 PCR擴增產(chǎn)物的堿基 對長度。

簡介
由于樣品制備過程中可能存在污染、技術錯誤和時間限制，復雜方案(例如巢式 PCR 和多重 PCR) 的效率和準確性難以保障。多重 PCR 實驗用于 GMO (轉基因生物)檢測、法醫(yī)學、食品分析、突變和多態(tài)性檢測、基因缺失分析、模板定量、連鎖分析以及更多應 用。這些多重反應非常高效，可在孔槽中產(chǎn)生兩個或多個擴增子的產(chǎn)物。

巢式 PCR 是另一種高度特異性的技術，可用作有用的診斷工具，用于識別生物樣品中的病原體，例如動脈粥樣硬化斑塊中的牙周病 原體、轉移性乳腺癌細胞以及結核分枝桿菌和馬爾尼菲青霉等病毒病原體與僅需要一個擴增步驟的標準PCR 不同，巢式 PCR 具有兩 步擴增過程。第一個 PCR 擴增步驟中生成的 PCR 擴增子用作第二個擴增步驟的模板。這些復合 PCR 實驗可能會因最終產(chǎn)品的不同 而變得繁瑣和耗時。Opentrons PCR 工作站可以自動化實現(xiàn) PCR 實驗，只需要進行非常少量的手動準備工作，就可以產(chǎn)出穩(wěn)定的一 致性結果。

材料和方法

多重 PCR 實驗步驟
使用從銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌分離的基因組 DNA 進行了多重 PCR 實驗。根據(jù)先前的研究，設計了針對銅綠假單胞菌 (lasl、lasR、gyrB) 和金黃色葡萄球菌(16s rRNA、clfA、mecA、Eubacterial 16S rRNA)多個位點區(qū)域特異性的正向和反向
引物。每個孔預期產(chǎn)物的大小分別為600、700和222bp。 在 Opentrons OT-2 的平臺上，在0.1 ml 96 孔全裙邊 NEST 板上準備 了20 μL的多重 PCR反應混合物，并使用設備上的熱循環(huán)儀進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時，為了對比分析， 我們也用手動準備了相同的實驗，并在第三方手動熱循環(huán)儀上運行。

巢式 PCR 實驗步驟
巢式 PCR 是用于鑒定從 lambda 噬菌體分離的生物樣品中的病原體的方法。根據(jù)先前的研究，針對銅綠假單胞菌 (lasl、lasR、 gyrB) 和金黃色葡萄球菌(16S rRNA、clfA、mecA、Eubacterial 16S rRNA) 設計了特異性的多個位點區(qū)域的正向和反向引物。 PCR組分被提供給OT-2 平臺，并轉移到0.1 ml96 孔 NEST板中。在混合和 Opentrons 熱循環(huán)模塊自動密封之前，最后加入 DNA 模板。對于第二個擴增步驟，使用0.1 ml 的 NEST 孔板重復此過程，并將其密封后放置在第三方熱循環(huán)儀上。第一次擴增的擴增產(chǎn) 物被用作陽性對照。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。所有實驗都使用Qubit BR定量，并計算變異系數(shù)以評估擴增的一致性。

實驗結果
使用Opentrons 熱循環(huán)模塊在OT-2上進行自動化多重PCR實驗，運行結果顯與第三方熱循環(huán)儀相當。

多重 PCR的實驗布局采用了 Kim 等人在2018年的研究中的方法。樣品孔位標記為綠色，陰性對照標記為藍色(見圖1)。

為了評估自動化多重 PCR 的高靈敏度和特異性，在凝膠上進行PCR 產(chǎn)物檢測。與第三方熱循環(huán)儀生成的PCR 產(chǎn)物相比(圖2B), OT-2熱循環(huán)儀上生成的 PCR 擴增產(chǎn)物不僅顯示出更清晰和明顯的條帶，而且長度符合預期 (lasl為600bp,lasR 為700bp,gyrB 為222bp) ( 圖 2A)。
為了進一步證明 OT-2 的效率，使用針對金黃色葡萄球菌(16s rRNA 、clfA 、mecA 、Eubacterial 16s rRNA) 的特異性引物進行 了自動化多重 PCR。預期的堿基對長度分別為791bp、638bp、499bp 和371bp, 并在瓊脂糖凝膠上檢測(圖2C) 。 同時，使 用相同的PCR組分進行了手動多重 PCR協(xié)議，使用第三方熱循環(huán)儀進行操作(圖2)。在 OT-2上自動化和手動進行的多重 PCR都 顯示出了類似的擴增效果(圖2A、2B)。

在每個孔位上測試的銅綠假單胞菌基因組DNA 中擴增了預期長度為600、700和222 bp 的lasl、lasR和gyrB目標。
A)1-8 道顯示了在OT-2 上自動加樣和熱循環(huán)后的產(chǎn)物。
B)1-8 道顯示了在第三方熱循環(huán)儀上手動加樣后的產(chǎn)物。在每個孔位上測試的金黃色葡萄球菌基因組DNA 中擴增了預期長度為 791、638、499和371 bp 的16S rRNA、clfA、mecA和真菌的16S rRNA目標。
C)1-8 道顯示了在OT-2 上自動加樣和熱循環(huán)后的產(chǎn)物。
D)1-8 道顯示了在第三方熱循環(huán)儀上手動加樣后的產(chǎn)物。

為了驗證在OT-2 和第三方熱循環(huán)儀上生成的 PCR 的精確性，分析了變異系數(shù) (CV%), 結果顯示在多重 PCR 和 巢 式 PCR 實驗中， OT-2 的 CV% 值與第三方熱循環(huán)儀相比相同或較低，表明擴增的均勻性更好(見表1)。

表1:在不同模板類型和PCR實驗中表現(xiàn)出高度均勻的擴增效果。
CV值(變異系數(shù))為經(jīng)過Qubit 定量后計算得出的結果，分別顯示了在OT-2 和第三方熱循環(huán)儀上進行的每個實驗的CV值。

在巢式?PCR?的布局中，樣品孔以綠色標記，陰性對照孔以藍色標記(圖3)

設計了兩組引物，用于檢測 Lambda  模板 DNA 的500 bp 和247 bp 區(qū)域。第一次PCR 運行中檢測到了500 bp 區(qū)域，而第二次 PCR 運行中檢測到了247bp  區(qū)域。樣品進行了三次巢式 PCR 重復實驗，然后在 PCR 運行結束后對擴增產(chǎn)物進行分析。

在瓊脂糖凝膠上分析了在?OT-2 ?和第三方熱循環(huán)儀上生成的?PCR擴增產(chǎn)物(圖4)。外層擴增片段的預期大小為500 bp, ???內(nèi)層擴增片?段為247 bp?。PCR?擴增產(chǎn)物顯示出類似的產(chǎn)量和變異系數(shù) (CV%) ???(表1),實驗結果說明了?OT-2 ?的產(chǎn)出與手工操作和第三方設備?一致。

結論

Opentrons  PCR 工作站與第三方手動熱循環(huán)儀對比，在 PCR 擴增產(chǎn)物的堿基長度方面表現(xiàn)出精確的擴增能力，并且移液精準度高。此  外，Opentrons PCR 工作站展示了在一個孔中準確進行多重 PCR 以及巢式 PCR 實驗的擴增能力。