作者

Boren ??Lin,PhD',Kinnari ??Watson,PhD 1Opentrons??Labworks,Inc.

摘要
本次測(cè)試研究的是在 Opentrons OT-2 自動(dòng)化移液工作站上進(jìn) 行基于磁珠的固定化金屬親和層析法 (IMAC) 。 我們使用 PierceTM Ni-NTA 磁性瓊脂糖珠 (Thermo Fisher Scientific, USA) 測(cè)試了該方案，用于在OT-2 上提取目標(biāo)蛋白(帶有 His 標(biāo)簽的 GAPDH), 使用裂解緩沖液稀釋的重組 GAPDH 蛋白、HEp-2 細(xì)胞裂解液和菌細(xì)胞制備的樣品。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)
在Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站上可使用 Ni-NTA 磁珠進(jìn)行重組 GAPDH 蛋白純化。
■ 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明所得蛋白為目標(biāo)蛋白，具有良好的一致性和 特異性。
■ i該方案可以處理多達(dá)96個(gè)樣品，并最大限度地減少需要手動(dòng)操作的時(shí)間。

簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)純化的目的是為了獲得高純度的穩(wěn)定活性蛋白質(zhì)，以供下游分析、研究或治療使用。固定化金屬親和層析法 (IMAC)利用金屬離子提取具有基因工程標(biāo)簽的重組蛋白，能夠螯合金 屬離子的肽鏈。鎳-三乙醇胺四乙酸 (Ni-NTA) 與瓊脂糖樹脂 或磁珠結(jié)合是常用的 IMAC 工具，用于純化多組氨酸 (His) 標(biāo) 記的蛋白質(zhì)。由于His殘基可以整合鎳離子(Ni?+),His 標(biāo)記的蛋白對(duì)固定了 Ni2* 的載體表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力。在 Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站上使用 Pierce Ni-NTA 瓊脂糖磁珠提取帶有 His標(biāo)簽的GAPDH。

材料和方法
IMAC Protocol 實(shí)驗(yàn)流程概述
IMAC protocol 的流程分為幾個(gè)部分：
第一部分：樣品/磁珠混合物的制備。目標(biāo)捕獲部分不在OT-2平臺(tái)上進(jìn)行。
第二部分：洗滌和洗脫。具體流程如圖1所示。
第一部分和第二部分都在OT-2 上執(zhí)行。針對(duì)96個(gè)樣品，第一 部分運(yùn)行時(shí)間為57分鐘，隨后在搖床上進(jìn)行30分鐘的目標(biāo)捕獲。第二部分需要78分鐘完成。

OT-2 平臺(tái)上的 Ni-NTA 實(shí)驗(yàn)流程
第一部分和第二部分的設(shè)備布局圖如下(見圖2)。協(xié)議的第 一部分和第二部分均在 OT-2 平臺(tái)上進(jìn)行，并使用磁珠純化模 塊將磁珠從溶液中分離出來。樣品處理過程中，將500 μL 人 源 His標(biāo)記的 GAPDH 溶液與12.5 μL 沉淀的磁珠混合，并在 室溫下以800 rpm 的速度孵育30分鐘。經(jīng)過2 個(gè)洗滌步驟 后，目標(biāo)蛋白在250 μL 洗脫緩沖液中以800 rpm 和室溫的條 件在搖床上洗脫10分鐘。取20 μL 洗脫物進(jìn)行 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析，使用單克隆抗-GAPDH 抗體 (Thermo Fisher Scientific,USA)和與熒光染料偶聯(lián)的二抗 (LI-COR Biosciences,USA) 進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果
GAPDH 在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中提取得到 一 致的樣品處理結(jié)果(通過Western blot 分析的蛋白帶信號(hào)測(cè)定， CV=6%) ( 圖3)。部分提取物通過使用 QubitTM 蛋 白 質(zhì) 分 析 (ThermoFisher Scientific,USA) 進(jìn)行定量，證明了高蛋白質(zhì)產(chǎn)量( 圖 4A) 。 此 外 ， 使 用Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站進(jìn)行 的蛋白質(zhì)純化過程不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的酶活性，這是通過GAPDH 活 性 分 析 (Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)檢 測(cè) 得 出 的 ( 圖 4B)。

Ni-NTA 介導(dǎo)的敲低實(shí)驗(yàn)對(duì)于在細(xì)胞或組織樣本中分離 外源表達(dá)的 His 標(biāo)記蛋白質(zhì)非常有用。上一個(gè)方案用于純 化 2 0 0 μLHEp-2 細(xì)胞裂解液中的 His 標(biāo) 記 GAPDH。
結(jié)果再次證明 His-GAPDH 成功被提取，并且與非標(biāo)記 蛋白的結(jié)合相比，Ni-NTA 磁珠的親和力特異性非常高 (圖5)。在大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)中，常用大腸桿菌進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。通過裂解帶有或不帶 IPTG 誘導(dǎo)的 His標(biāo)記 GAPDH 表達(dá)的細(xì)菌細(xì)胞來制備細(xì)胞裂解液。結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了該方案成功地使用 Ni-NTA 磁珠進(jìn)行了帶有 His 標(biāo) 記 的 蛋 白 質(zhì) 純 化 ( 圖 6 ) 。
在這項(xiàng)研究中處理了96個(gè)樣本，顯示的結(jié)果僅為在96 孔樣品板的最后 一 列中的8個(gè)樣品。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也對(duì)不同樣本規(guī)模的運(yùn)行時(shí)間進(jìn)行了評(píng)估(圖7)。

結(jié)論
本次研究在 Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站上運(yùn)行了一種基于磁珠的 His 標(biāo)記重組 GAPDH 蛋白質(zhì)純化的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程解 決方案。實(shí)驗(yàn)證明， Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站可以在中到高通量的設(shè)置中穩(wěn)定高效地處理樣本，減少操作時(shí)間，同時(shí)提供符合預(yù)期的可重復(fù)性的產(chǎn)出。

原文地址：使用 Opentrons 蛋白質(zhì)純化工作站進(jìn)行基于 Ni-NTA 磁珠的蛋白質(zhì)純化