摘要
三個(gè)圖書(shū)館準(zhǔn)備工具包-Illumina?DNA準(zhǔn)備工具包，KAPA?超級(jí)準(zhǔn)備工具包和NEBNext?Ultra?II試劑盒-都是通過(guò)Opentrons OT-2自動(dòng)快速和穩(wěn)健地制備下一代測(cè)序的高質(zhì)量文庫(kù)。
從lambda和人類(lèi)基因組DNA中制備了100 ng輸入的文庫(kù)。
觀察到庫(kù)的類(lèi)似性能，用OT-2上的三個(gè)套件準(zhǔn)備的樣本變異性和產(chǎn)量。類(lèi)似的排序指標(biāo)，如條形碼平衡和序列比對(duì)也觀察到覆蓋范圍。

介紹
DNA文庫(kù)的制備是下一步工作的關(guān)鍵步驟代測(cè)序（NGS）。自動(dòng)化的DNA文庫(kù)制備為構(gòu)建高產(chǎn)測(cè)序文庫(kù)提供了一種簡(jiǎn)化的方法同時(shí)盡量減少實(shí)際操作時(shí)間。在這里，我們描述海百合DNA制備自動(dòng)化的效率裝備(伊利，CatNo。20018705)，KAPA超級(jí)試劑盒(羅氏?. , CatNo.7962363001)和NEBNext超II試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室?. , CatNo.E7645L)在OT-2機(jī)器人液體處理平臺(tái)上。

材料和方法
Illumina DNA制備試劑盒、KAPA超級(jí)制備試劑盒、NEBNext Ultra II和視中心OT-2平臺(tái)概述
擁有專(zhuān)利NGS標(biāo)記工作流程，利用珠聯(lián)轉(zhuǎn)座體，這不同于KAPA HyperPrep和NEBNext Ultra II工作流程-DNA末端修復(fù)和a尾的解決流程。

對(duì)于Illumina DNA準(zhǔn)備試劑盒，使用OT-2上的雙索引適配器對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記和標(biāo)記。DNA樣品（n=8,100 ng）量化，歸一化到一個(gè)4 nM的庫(kù)，匯集到一個(gè)多路復(fù)用的樣本，然后在一個(gè)2x75上運(yùn)行在Illumina MiSeq上的流式細(xì)胞進(jìn)行基因組測(cè)序。工作流程包括生成DNA準(zhǔn)備庫(kù)Lambda（n=24）和人類(lèi)基因組DNA樣本（n=8）。

對(duì)于HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA制備試劑盒，我們?cè)贠T-2上構(gòu)建了抗體DNA片段（n=8,100 ng）的DNA文庫(kù)。使用的條形碼來(lái)自KAPA獨(dú)特的雙索引適配器，和NEB多重雙索引II為NEBNext索引設(shè)置1。樣本被定量、歸一化，并匯集到一個(gè)4 nM的文庫(kù)中，并在一個(gè)帶有2x75的MiSeq上進(jìn)行測(cè)序流路池該工作流程包括為=片段DNA（n=24）和人類(lèi)基因組DNA（n=8）生成文庫(kù)。

測(cè)序數(shù)據(jù)由Illumina公司進(jìn)行解復(fù)用
基本空間?根據(jù)適配器的條形碼序列，并與參考基因組對(duì)齊。利用Geneious技術(shù)對(duì)該基因組的覆蓋圖譜進(jìn)行了分析?主要的2021.2.21. 我們的數(shù)據(jù)顯示了較低的樣本變異性和在OT-2上使用DNA制備試劑盒制備的文庫(kù)的可靠一致性。

OT-2工作流協(xié)議的原理圖

對(duì)于Illumina的DNA準(zhǔn)備試劑盒，DNA和IDT?為了伊利DNA/RNA UD指數(shù)集A。.
在OT-2上進(jìn)行了標(biāo)記（圖1）。A
清洗步驟是必要的，以去除殘留的DNA和適配器接下來(lái)，使用具有可編程蓋子和塊溫度的OT-2甲板上熱循環(huán)器進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)于HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA制備試劑盒，都用NEB片段酶進(jìn)行片段化。
人類(lèi)16分鐘，人類(lèi)20分鐘基因組DNA，然后用AMPure進(jìn)行清理?XP珠子(貝克曼庫(kù)爾特，CatNo。. A63881).對(duì)OT-2進(jìn)行DNA末端修復(fù)/A尾跡，然后是AMPure XP珠子清理步驟、條形碼或適配器連接（圖1）。使用的條形碼來(lái)自KAPA獨(dú)特的雙索引適配器(羅氏，CatNo。08861919702). 對(duì)于HyperPrep和NEB多重雙索引引物集1 (NEB，CatNo。E7335L)為NEBNext Ultra II。.

使用甲板上的熱循環(huán)器在OT-2上進(jìn)行DNA擴(kuò)增。

工作流布局
Opentrons OT-2平臺(tái)的布局包括模塊、實(shí)驗(yàn)室軟件和DNA準(zhǔn)備試劑（圖2）。
雖然工作流程包括在OT-2上的自動(dòng)移液，但需要手動(dòng)干預(yù)，在甲板上的恒溫器和磁塊之間移動(dòng)樣品板，并在此期間重置移液管尖端架協(xié)議。

圖2：OT-2甲板布局

模塊，實(shí)驗(yàn)室軟件，和DNA準(zhǔn)備試劑。這個(gè)

標(biāo)準(zhǔn)化的甲板布局與HyperPrep和其他平臺(tái)共享

NEB下一個(gè)Ultra II。該工作流程在OT-2上自動(dòng)移液，需要手動(dòng)干預(yù)在甲板上恒溫筆和之間移動(dòng)樣品板(1)

磁性磁塊(2)，以及在運(yùn)行過(guò)程中重置尖端機(jī)架。甲板布局包括1個(gè)NEST 12井儲(chǔ)層，1 x 96井鋁塊，1個(gè)熱循環(huán)器上的200μl PCR板，溫度模塊上的1個(gè)NEST0.1 mL PCR板(3)。模塊包括一個(gè)磁性模塊、溫度模塊、熱循環(huán)器模塊，以及P20和P300 8通道移液管。

結(jié)果
DNA文庫(kù)擴(kuò)增
使用PicoGreen檢測(cè)DNA文庫(kù)?在一個(gè)量子位?4.用熒光計(jì)測(cè)定濃度。CV（變異系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)差除以平均值）。所有文庫(kù)的最終洗脫體積均為30μL。對(duì)于使用Illumina準(zhǔn)備的庫(kù)
DNAPrep（n=8,100ng）的CV為10.7%（n=24,100 ng）的CV為16.6%（表1A）。為文庫(kù)使用HyperPrep制備，CV為（n=8100ng）的13.4%，（n=24100ng）的CV為17.6

. 1B)使用NEBNext Ultra II制備的文庫(kù)顯示（=8）的CV為12.1%，（=24）的CV為14.5%
（表1C)。在OT-2上制備的lambda和人類(lèi)DNA文庫(kù)的產(chǎn)量（ng/μl）、CV（%）和片段大?。╞p）的比較見(jiàn)表2。

DNA制備文庫(kù)的小基因組測(cè)序
多路復(fù)用的DNA準(zhǔn)備文庫(kù)(n=8,100在Illumina上使用2x75流動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序MiSeq儀器。第二批DNA準(zhǔn)備文庫(kù)（n=24,100 ng）在OT-2上的3個(gè)單獨(dú)的列中進(jìn)行處理，以解釋一批內(nèi)的任何柱間可變性。安捷倫?5300年碎片分析儀計(jì)算

用DNA制備文庫(kù)的片段大小來(lái)確定
在OT-2上制備的文庫(kù)的可靠均勻性（表3A-3C）。同樣，在OT-2上構(gòu)建的48 kb基因組的一致測(cè)序覆蓋顯示了8倍路DNA制備文庫(kù)的一致性
（表4）。

條形碼平衡是準(zhǔn)確的DNA準(zhǔn)備樣本顯示的平均11.2%–12.31%的伊利米納
DNA Prep，KAPA HyperPrep的10.6%–14.1%，NEBNextUltraII的10.5%–14.6%（圖3）.
比較DNA制備試劑盒的尖端分配和OT-2方案的持續(xù)時(shí)間（表5）。

結(jié)論
我們驗(yàn)證了免疫DNA準(zhǔn)備，KAPA超準(zhǔn)備，和NEBNext Ultra II在OT-2和演示了它在下一代測(cè)序的文庫(kù)制備中的應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)，DNA Prep樣本在復(fù)制和化學(xué)中表現(xiàn)出低可變性，甚至樣本條形碼平衡，并且高序列比對(duì)的覆蓋范圍，表明OT-2可以用來(lái)可靠地自動(dòng)化制備高質(zhì)量的DNA文庫(kù)。

原文地址：使用DNA制備試劑盒自動(dòng)制備小基因組的文庫(kù)