應(yīng)用介紹
2020年新冠病毒肆虐全球，激化了人類對(duì)于臨床研究目的的高通量 RNA 檢測(cè)和基因測(cè)序的需求。傳統(tǒng)手動(dòng)操作方案難以提升RNA 檢測(cè)的效率。在本項(xiàng)研究中，我們展示了在 Opentrons OT-2 自動(dòng)化移液工作站上使用 Beckman Coulter Life Sciences RNAd- vance Viral 試劑盒 (C63510) 的自動(dòng)化 SARS-CoV-2 RNA 提取工作流程。 我們提供的分析數(shù)據(jù)顯示了通過 qRT-PCR 定量的SARS-CoV-2 檢測(cè)限(LoD) 和序列比對(duì)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為自動(dòng)測(cè)序樣品和文庫制備提供了依據(jù)，以便對(duì)突變株進(jìn)行遺傳鑒定。

RNAdvance 病毒試劑盒和 OT-2 平臺(tái)概述
RNAdvance Viral kit 通過利用 SPRI 順磁珠技術(shù)，從樣品中高效提取病毒RNA。 我們?cè)谧詣?dòng)化的 Opentrons 平臺(tái)上使用了這種試 劑，從合成鼻基質(zhì)(110mM NaCl,1%w/v的豬胃I 型粘液 (Sigma M2378-100G) 和10μg/mL w/v人類基因組 DNA(Coriell NA12878), 以90%v/v 的TE/SNM) 樣品中提取了不同濃度的熱滅活的 SARS-CoV-2(ATCC°VR-1986HKTM) 。 每個(gè)濃度包括20 個(gè)測(cè)試樣品、2個(gè)陽性對(duì)照和2個(gè)陰性對(duì)照。

工作流程吞吐量
圖1顯示了自動(dòng)化 RNAdvance 病毒提取工作流程的 OT-2甲板布局。該工作流程從向樣品裂解液中添加 Bind (BBB)開始，每個(gè)樣 品僅需要消耗10個(gè)吸頭，可靈活運(yùn)行8個(gè)批次大小的最多96個(gè)樣本。報(bào)告中描述的工作流程持續(xù)時(shí)間包括實(shí)際操作時(shí)間、樣品裂解時(shí)間和優(yōu)化后樣品的運(yùn)行時(shí)間(圖2)。
使用 RNAdvance Viral試劑盒和OT-2平臺(tái)，處理96個(gè)樣本的工作流程總共需要3.5小時(shí)，您可以復(fù)制鏈接到瀏覽器，查看具體協(xié)議流程： https://protocols.opentrons.com/protocol/bc-rnadvance-viral。您可以根據(jù)您的需求靈活地改變方法變量，以獲得您所需要的批次大小、樣品輸入和洗脫體積的所需結(jié)果。

該工作流程在 ?OT-2?上是可以全自動(dòng)運(yùn)行??的，每個(gè)樣品使用10個(gè)吸頭，并從加入Bind(BBB) ???開始。實(shí)驗(yàn)甲板上耗材內(nèi)容有：最多10個(gè)吸頭架、1個(gè)?NEST?單孔儲(chǔ)液槽、2個(gè)?NEST 12?孔儲(chǔ)液槽、1個(gè) NEST?0.1mL?PCR板和1個(gè)?NEST ?2mL?深孔板，模塊包括一個(gè)磁珠純化模塊和一個(gè)溫控模塊，配備一個(gè)?P300?多通道移液器。所有的?NEST 耗材和模塊都由?Opentrons 提供。

圖2:在OT-2平臺(tái)上使用RNAdvance Viral試劑盒的吞吐量情況
整個(gè)工作流程運(yùn)行所需的時(shí)間包括3個(gè)部分：操作時(shí)間、裂解時(shí)間和運(yùn)行時(shí)間。操作時(shí)間包括樣品和OT-2的準(zhǔn)備工作。運(yùn)行時(shí)間指的是 OT-2從開始到完成整個(gè)協(xié)議所需的時(shí)間。
A)處理8個(gè)樣品需要45分鐘，處理96個(gè)樣品需要2小時(shí)38分。
B) 圖形化展示了不同樣品數(shù)量下的運(yùn)行處理時(shí)間。

RNAdvance 病毒試劑盒檢測(cè)限制
檢測(cè)限制(LoD)是用于確定OT-2平臺(tái)上自動(dòng)化RNAdvance Viral提取效率的指標(biāo)，它表示能夠在≥95%的重復(fù)測(cè)量中檢測(cè)到的病毒拷貝數(shù) 的最低濃度。我們使用2019-nCoV CDC N1和RP引物和探針(2019-nCoV CDC EUA kit,Integrated DNA Technologies (IDT)) 進(jìn)行探 測(cè) ，PCR 混合液和酶使用Luna°通用探針一步RT-qPCR 試劑盒(New England BioLabs),PCR反應(yīng)在PCRmax ECO48實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)上 進(jìn)行。在SARS-CoV-2 樣本 (n=20) 和陽性對(duì)照樣本 (n=2) 中檢測(cè)到病毒RNA (拷貝數(shù)/μL), 但在陰性對(duì)照樣本 (n=2) 中未檢測(cè)到。根據(jù)表1的總結(jié)，分析范圍內(nèi)的所有對(duì)比陽性樣本均被確定為陽性，其中最低濃度的病毒RNA 拷貝數(shù)為1拷貝/μL。PCR 參數(shù)如下。

表1:使用OT-2 平臺(tái)和 RNAdvance Viral 試劑盒檢測(cè) SARS-CoV-2 目標(biāo) N1 的病毒靈敏度。1 copy/μL 是能夠檢測(cè)到≥95%樣本的最低濃度，被定義為檢測(cè)限制 (Limit of Detection,LoD)

為了研究 RNAdvance Viral在 OT-2 上的自動(dòng)化性能，我們將850 copy/μL 濃度的熱滅活 SARS-CoV-2 病毒加入合成鼻腔基質(zhì)中，并提取RNA。 針對(duì)N1和RP, 確定了均值Ct值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù) (CV%) 和檢測(cè)率等規(guī)格參數(shù)(圖3A)。
在實(shí)驗(yàn)樣本(n=20)、 陽性對(duì)照樣本(n=2) 和陰性對(duì)照樣本(n=2) 中，對(duì)N1 的擴(kuò)增曲線進(jìn)行定量分析(圖3B), 同時(shí)對(duì)包括對(duì)照樣本在內(nèi)的樣品中的RP進(jìn)行定量分析(圖3C)。

DNA 測(cè)序和數(shù)據(jù)分析
為了進(jìn)一步了解測(cè)序性能，我們使用Swift 2S Turbo DNA文庫制備試劑盒和 Swift Unique Dual Indexing 引物板進(jìn)行 N1擴(kuò)增。關(guān)于850 copy/μl 樣本的詳細(xì)數(shù)據(jù)和序列比對(duì)結(jié)果可以在圖4 中找到。我們觀察到平均覆蓋率為 455x, 并且平均讀數(shù)有91%與參考基因組 SARS-CoV-2 分離自Wuhan-Hu-1(NC_045512.2) 對(duì)齊。讀取長度與 N1擴(kuò)增區(qū)域相匹配，大約為72個(gè)堿基。根據(jù)Swift 2s Turbo DNA 文庫制備試劑盒制造商的說明，預(yù)期插入片段大小約為 200bp。 測(cè)序是使用 lllumina MiSeq 進(jìn)行的，并將篩選數(shù)據(jù)上傳至llluminaBaseSpace。在 Galaxy 中使用 Bowtie2 確定了覆蓋度，并使用 Integrative Genome Viewer(IGV) 進(jìn)行可視化。NC_045512.2,SAR2-COV-2, 分離源自Wuhan-Hu-1 的基因組是用于測(cè)序的NCBI參考基因組。通過在 Galaxy 中使用QualiMap-BAMQC 工具，分析了調(diào)準(zhǔn)、讀長、片段大小和CG含量等信息。

A) 綜合數(shù)據(jù) QC 表描述了多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，包括455-x 的平均覆蓋率和與參考基因組對(duì)齊的平均讀數(shù)，SARS-CoV-2 分離株 Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) 為91%。根據(jù) Swift 2s Turbo DNA Library Prep 制造商的預(yù)期插入片段大小約為200bp。
B)每個(gè)樣本與參考基因組對(duì)齊的對(duì)比。

總結(jié)
本研究通過 Beckman Coulter Life Sciences RNAdvance Viral 試劑盒和 Opentrons OT-2 提供了一個(gè)穩(wěn)定、高性價(jià)比的自動(dòng)化提取方 案。該工作流程經(jīng)過優(yōu)化，用于SARS-CoV-2 病毒 RNAPCR 檢測(cè)，在LoD (檢測(cè)限制)為每微升1個(gè)拷貝時(shí)進(jìn)行了測(cè)量。我們使用了高 通量測(cè)序 (NGS) 進(jìn)行測(cè)試，在平均樣本覆蓋度達(dá)到455 X 和平均讀數(shù)對(duì)齊到 SARS-CoV-2 參考基因組的91%。該研究表明，利用 RNAdvance Viral 試劑和 Opentrons OT-2 進(jìn)行樣本提取可以實(shí)現(xiàn)高效且經(jīng)濟(jì)的 SARS-CoV-2 病毒 RNA 提取。同時(shí)，在測(cè)序分析方面， 該方案具有高平均覆蓋度和較高的對(duì)齊率，能夠?yàn)檠芯咳藛T提供具有重要意義的遺傳信息。這對(duì)于致力于研究SARS-CoV-2 病毒的臨床研究人員來說，為他們的工作提供了一種高效、可行的樣本準(zhǔn)備方案。