作者

Boren ?Lin,PhD1,Kinnari ?Watson,PhDl 1Opentrons??Labworks,Inc.

摘要
本次研究在Opentrons OT-2自動(dòng)化移液工作站上進(jìn)行了自 動(dòng)化的磁珠法免疫沉淀測試，實(shí)驗(yàn)流程可處理多達(dá)96個(gè)樣 品，并最大限度地減少人工操作時(shí)間。我們用裂解緩沖液 稀釋重組 GAPDH 蛋白或者直接使用 HEp-2 細(xì)胞裂解產(chǎn)物 進(jìn)行樣本制備，并偶聯(lián)蛋白G 或者蛋白A, 然后在 Thermo Fisher Dynabeads 上進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(蛋白G和蛋白A 可與可溶性抗體結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)隨后與目標(biāo)蛋白 GAPDH 的 結(jié)合)。蛋白質(zhì)分析結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白質(zhì)成功地從樣品溶 液中提取出來，并符合預(yù)期效果的一致性，證明了 OT-2 具備自動(dòng)化進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的能力。

簡介
免疫沉淀是一種常見的實(shí)驗(yàn)方法，利用抗體在分子混合物 中捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)?？贵w可以預(yù)先連接到固相基質(zhì)(如瓊 脂糖樹脂或磁珠)上，然后與目標(biāo)蛋白質(zhì)接觸，或者直接 與樣品一起加入相應(yīng)的固相基質(zhì)。由于孵育時(shí)間取決于抗 體與目標(biāo)蛋白質(zhì)的親和力，不同的目標(biāo)捕獲蛋白所需的孵 育時(shí)間也會(huì)不一樣。使用磁珠提取，抗體-蛋白質(zhì)-磁珠復(fù)合物會(huì)通過離心或磁力的方式進(jìn)行沉淀收集。

DynabeadsM(Thermo Fisher Scientific,USA) 是一款可 以根據(jù)需求調(diào)整以獲得不同功能的超順磁珠。例如，重組的 蛋白G或蛋白A可以共價(jià)地結(jié)合到磁珠表面。蛋白G和蛋白A 都是細(xì)菌蛋白，對(duì)單克隆或多克隆 IgG 型抗體的 Fc 區(qū)域表現(xiàn) 出高親和力。DynabeadsTM- 蛋白G 或 DynabeadsTM- 蛋白 A可作為抗體的固相支持材料。Opentrons 以 DynabeadsM為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了高效自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)可處理最多96個(gè)樣品，樣品之間具有良好的重復(fù)性。

材料和方法
實(shí)驗(yàn)步驟包括以下內(nèi)容：
第一部分是磁珠、抗體和樣品的混合制備；由用戶確定的抗體/目標(biāo)蛋白的孵育時(shí)間；
第二部分是洗滌和洗脫步驟(圖1)。
第一部分和第二部分在 OT-2 上進(jìn)行，使用磁珠純化模塊將磁 珠從溶液中分離出來，并使用溫控模塊制備變性蛋白的洗脫液進(jìn)行 SDS-PAGE。 孵育過程在熱振蕩儀(選配)上進(jìn)行。
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的第一部分和第二部分的 OT-2 裝載布局如圖2 所示。這個(gè)流程旨在將試劑直接從15 mL 離心管轉(zhuǎn)移到工作板上進(jìn)行磁珠分離。
另外，在 OT-2 上使用自動(dòng)化程序預(yù)填充試劑板，可以減少實(shí) 驗(yàn)時(shí)間?？贵w與目標(biāo)蛋白的結(jié)合是免疫沉淀成功的最關(guān)鍵步 驟，這取決于抗體的親和力。對(duì)于結(jié)合親和力低或豐度較低的抗體，建議在樣品溶液中進(jìn)行預(yù)孵育。

結(jié)果
兔子IgG 對(duì) 蛋 白G 和蛋白A 都具有高親和性，為了確認(rèn)抗體與 DynabeadsM 的相互作用，我們使用了抗 GAPDH 的免多克隆 gG 抗體(ProteintechRosemont,IL,USA) 。 在 OT-2 上，將 50μL 的磁珠懸液與含有2.5μg GAPDH 抗體的200μL PBS 混 合，然后室溫下于振蕩器上800 rpm 混勻10分鐘。隨后，在 OT-2上用0 . 1% Tween 20 的磷酸鹽緩沖生理鹽水 (PBS-T) 洗滌3次。70°℃加熱10分鐘、使用Laemmli 樣品緩沖液 (Bio-Rad,USA) 洗脫結(jié)合的 GAPDH 抗體。然后，對(duì)其進(jìn) 行SDS-PAGE 分離，再用近紅外發(fā)光染料 (IRDye 680RD)偶 聯(lián)的山羊抗兔 IgG 抗體 (LI-COR Biosciences,USA)進(jìn)行探針探測。Western Blot 分析結(jié)果顯示，當(dāng)進(jìn)行四次重復(fù)操作時(shí)，無論是蛋白G 還是蛋白A 磁珠都能夠與 GAPDH 抗體結(jié)合(圖5A), 且結(jié)合具備可重復(fù)性。
為了進(jìn)行 GAPDH 的免疫沉淀，我們?cè)?OT-2 上使用含有重組 人 GAPDH 蛋 白(rhGAPDH,Thermo Fisher Scientific, USA) 的樣品進(jìn)行免疫沉淀處理。同時(shí)使用結(jié)合了 GAPDH 抗 體的 DynabeadsTM-蛋白G和蛋白A的 GAPDH抗體進(jìn)行測試。 Western Blot結(jié)果顯示出GAPDH 的存在，驗(yàn)證了OT-2 具備運(yùn)行自動(dòng)化免疫沉淀的能力(圖5B)。
該方法還針對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)源性 GAPDH 進(jìn)行了自動(dòng)化免疫沉淀評(píng)估。HEp-2 細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的 GibcoTM最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific,USA) 中培養(yǎng)，在5% CO2 和37°℃條件下進(jìn)行。為了準(zhǔn)備測試的細(xì)胞裂解液，收集了4 x106 個(gè) HEp-2 細(xì)胞，并在200μLPierceTM IP 的裂解緩沖液中進(jìn)行裂解，該緩沖液中還加入了Thermo Fisher Scientific 提供的蛋白酶抑制劑混合物。使用DynabeadsTM- 蛋白A在 OT-2 平臺(tái)上進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，OT-2移液平臺(tái)搭載了磁珠純化模塊和溫控模塊。為了讓抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合有足夠的時(shí)間，將混合物放置于4°℃熱振蕩儀上，在800 rpm的轉(zhuǎn)速下孵育過夜。最后通過Western Blot 定量，結(jié)果進(jìn)一步證明了本次免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功具有良好的重復(fù)性(圖6)。本次實(shí)驗(yàn)處理了96個(gè)樣本，免疫沉淀的細(xì)胞裂解液加載在96孔樣品板的最后一列，而樣品板的其余位置只裝載了裂解緩沖液。

結(jié)論
OT-2 在中高通量工作流程中利用 Dynabeads 進(jìn)行自動(dòng)化免疫沉淀具備較好的能力和實(shí)用性。我們開發(fā)的應(yīng)用協(xié)議能夠替代手動(dòng)程序，并減少了操作時(shí)間，同時(shí)提供了優(yōu)秀的重復(fù)性。

原文地址：在OT-2上使用Thermo Fisher Dynabeads 進(jìn)行免疫沉淀