在探索高通量測(cè)序（NGS）的廣闊領(lǐng)域中，文庫(kù)定量作為確保測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量與深度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，扮演著至關(guān)重要的角色。這一步驟不僅關(guān)乎實(shí)驗(yàn)的成功與否，還直接影響到后續(xù)生物信息學(xué)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，文庫(kù)定量的方法日益多樣化，每種方法都各具特色，適用于不同的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景和需求。

文庫(kù)定量

一、文庫(kù)定量的重要性
1、確保測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量：文庫(kù)定量可以確保測(cè)序儀上載入的DNA文庫(kù)量適中，從而避免文庫(kù)濃度過(guò)高導(dǎo)致的低質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)或文庫(kù)濃度過(guò)低導(dǎo)致的測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量不足。
2、穩(wěn)定產(chǎn)出各樣本數(shù)據(jù)量：在多個(gè)文庫(kù)合并測(cè)序時(shí)，文庫(kù)定量有助于根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)量的要求混合相應(yīng)摩爾量的文庫(kù)，以穩(wěn)定產(chǎn)出各樣本數(shù)據(jù)量。

二、常見(jiàn)方法
1、紫外分光光度法
（1）原理：核酸（包括DNA和RNA）中的堿基含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm處，與此同時(shí)，還能通過(guò)計(jì)算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計(jì)核酸的純度（280nm吸光通常來(lái)自蛋白質(zhì)，而230nm則通常來(lái)自糖類(lèi)和苯酚等）。
（2）缺點(diǎn)：無(wú)法區(qū)分DNA和RNA，因?yàn)榫哂凶贤馕盏慕Y(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當(dāng)一份樣品同時(shí)含有DNA和RNA的時(shí)候，測(cè)定濃度會(huì)高于其真實(shí)濃度。
2、熒光染料法
（1）原理：使用靶標(biāo)特異性染料，該染料可以特異地與不同種類(lèi)的核酸鏈相結(jié)合，并在特定波長(zhǎng)光源的激發(fā)下發(fā)出熒光。其中，結(jié)合了核酸的熒光染料相比那些游離的，信號(hào)可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以和背景區(qū)分開(kāi)來(lái)。
（2）操作：將待測(cè)DNA樣品與熒光染料混合，熒光染料會(huì)與DNA結(jié)合，形成熒光復(fù)合物。然后將混合物放入Qubit測(cè)量?jī)x器中，儀器會(huì)通過(guò)激光激發(fā)熒光復(fù)合物，使其發(fā)出熒光信號(hào)。Qubit測(cè)量?jī)x器會(huì)根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度自動(dòng)計(jì)算出DNA的濃度。
（3）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)流程高效，可以輕松地分析數(shù)十個(gè)樣本，內(nèi)置的分析軟件簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)計(jì)算，在檢測(cè)結(jié)束后立即呈現(xiàn)文庫(kù)濃度。
（4）缺點(diǎn)：當(dāng)樣本增加到20~30個(gè)以上時(shí)，此種檢測(cè)方法不太適用；檢測(cè)的準(zhǔn)確度略低，結(jié)果一般不作為終濃度用于上機(jī)。
3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qPCR）
（1）原理：利用熒光檢測(cè)技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化情況，反映濃度的變化，最后通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算未知樣品的濃度，以達(dá)到準(zhǔn)確定量文庫(kù)濃度。
（2）優(yōu)點(diǎn)：特異引物僅會(huì)定量?jī)啥私宇^連接完整的文庫(kù)，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾，準(zhǔn)確度高，是目前業(yè)內(nèi)進(jìn)行文庫(kù)定量推薦的方法，適用于測(cè)量珍貴樣本以及文庫(kù)上機(jī)pooling前的精準(zhǔn)定量。
（3）缺點(diǎn)：成本較高。

三、技巧
1、消除和避免核酸污染：文庫(kù)定量使用的Standards濃度從高到低，高濃度Standards容易對(duì)環(huán)境造成核酸污染，從而影響陰性對(duì)照和低濃度Standards的結(jié)果。因此，做文庫(kù)定量的實(shí)驗(yàn)室需要定期除核酸?？梢栽趯?shí)驗(yàn)技術(shù)后，用紫外處理，將環(huán)境中的核酸氧化。
2、文庫(kù)稀釋驗(yàn)證：文庫(kù)建議稀釋2個(gè)梯度，相互驗(yàn)證。說(shuō)明書(shū)上建議是10000倍和20000倍，在具體實(shí)驗(yàn)操作時(shí)設(shè)置2個(gè)梯度濃度相差10倍也可以。要注意的是10000倍和20000倍得出的Ct值的差應(yīng)該為1附近，可以在0.951.05之間，10000倍和100000倍得出的Ct值差在3.34附近，可以在3.23.5之間，如果超出這兩個(gè)區(qū)間，則2個(gè)梯度的誤差會(huì)比較大，這種誤差有可能是稀釋不準(zhǔn)引起。
3、排除擴(kuò)增效率影響：當(dāng)計(jì)算的結(jié)果出來(lái)，發(fā)現(xiàn)文庫(kù)稀釋成2個(gè)梯度所獲得的濃度偏差較大時(shí)，可能是由于稀釋不準(zhǔn)，或者該文庫(kù)的擴(kuò)增效率較低，導(dǎo)致△Ct偏大。此時(shí)，可以將這個(gè)文庫(kù)做4~5個(gè)10倍稀釋梯度，上機(jī)，根據(jù)上機(jī)的Ct值計(jì)算擴(kuò)增效率，從而排除擴(kuò)增效率的因素。

文庫(kù)定量作為高通量測(cè)序流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其重要性不言而喻。通過(guò)合理選擇定量方法和靈活應(yīng)用定量技巧，科研人員能夠更加精準(zhǔn)地掌握文庫(kù)的質(zhì)量信息，為后續(xù)的生物信息學(xué)分析和科學(xué)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

相關(guān)閱讀推薦

全自動(dòng)移液工作站快速入門(mén)指南

使用 Opentrons 進(jìn)行 COVID-19 檢測(cè)

OT-2液體處理機(jī)器人安全和法規(guī)合規(guī)信息

全自動(dòng)移液工作站質(zhì)譜前處理

全自動(dòng)移液工作站BCA和Bradford檢測(cè)

全自動(dòng)移液工作站用于培養(yǎng)基的配制的優(yōu)勢(shì)