現(xiàn)代數(shù)據(jù)分析方法（例如優(yōu)化算法或深度學(xué)習(xí)）已成功應(yīng)用于許多生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)問題。為了使這些方法有效，需要進(jìn)行大量高質(zhì)量且可重復(fù)的實驗，這需要高度自動化。在這里，我們介紹了一種開源硬件和低成本框架，可以自動高通量生成大量細(xì)胞生物學(xué)數(shù)據(jù)。我們的設(shè)計包括一個落射熒光顯微鏡，該顯微鏡帶有自動 XY 載物臺，用于移動裝有細(xì)胞的多孔板，以及一個灌注歧管，允許編程應(yīng)用多達(dá)八種不同的溶液。我們的系統(tǒng)非常靈活，可以輕松適應(yīng)個人實驗需求。為了證明該系統(tǒng)的實用性，我們已使用它進(jìn)行高通量 Ca 2+成像和大規(guī)模熒光標(biāo)記實驗。

介紹
過去十年發(fā)展起來的深度學(xué)習(xí)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (ANN) 已被證明可用于圖像分析、優(yōu)化任務(wù)和機(jī)器人技術(shù)（LeCun 等人，2015 年；Hinton，2018 年；Hinton 等人，2019 年）。它們在解決生物問題方面也越來越受歡迎。例如，基于 ANN 的細(xì)胞分割算法比傳統(tǒng)方法更準(zhǔn)確、更快（Hilsenbeck 等人，2017 年）。深度學(xué)習(xí)還有助于檢測人體組織中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞（Van Valen 等人，2016 年；Coudray 等人，2018 年）、優(yōu)化治療條件（Kusumoto 和 Yuasa，2019 年）以及解釋動物行為（Heras 等人，2019 年）。最近，已經(jīng)開發(fā)了一個在線平臺，讓沒有任何深度學(xué)習(xí)知識的研究人員可以在自己的應(yīng)用程序中使用它（von Chamier 等人，2020 年），進(jìn)一步提高了深度學(xué)習(xí)作為分析工具的實用性。

應(yīng)用深度學(xué)習(xí)和其他機(jī)器學(xué)習(xí)方法時，一個重要的考慮因素是訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的大小。通常，深度學(xué)習(xí)需要數(shù)千到數(shù)萬個數(shù)據(jù)點（O'Mahony 等人，2019 年）。這在生物實驗中通常是不可行的，因為它們通常需要很長時間才能完成。因此，需要能夠在最少的人工監(jiān)督下執(zhí)行數(shù)百或數(shù)千個實驗的自動化系統(tǒng)。這種自動化系統(tǒng)應(yīng)允許 (a) 在多個孔中進(jìn)行單細(xì)胞顯微鏡檢查（明場和/或熒光）（即具有 XY 載物臺）；(b) 自動應(yīng)用多種不同的解決方案；(c) 自動在線分析（例如，細(xì)胞分割和平均亮度的計算）。

市售熒光顯微鏡（例如 Olympus BX61、Nikon Ti Widefield 或 Nikon A1 共聚焦系統(tǒng)，以及活細(xì)胞成像系統(tǒng)，例如 Echo Revolve 或 Sartorius Incucyte）通常配備 XY 載物臺，可進(jìn)行多孔熒光成像。然而，這些系統(tǒng)價格昂貴（15,000-150,000 英鎊），并且僅提供有限的自動化解決方案應(yīng)用功能。許多市售系統(tǒng)（例如 Hamilton 或 Andrew）都允許這樣做，但由于其尺寸和成本，這些系統(tǒng)很難與實時成像相結(jié)合。

3D 打印以及 Arduino 和 Raspberry Pie 等廉價電子設(shè)備的發(fā)展引發(fā)了定制經(jīng)濟(jì)實惠的科學(xué)設(shè)備的革命，而這些設(shè)備以前只能在大型實驗室或大學(xué)設(shè)施中使用。這些設(shè)備不僅經(jīng)濟(jì)實惠，而且可以根據(jù)各個實驗室的需求進(jìn)行定制。此類技術(shù)的一個例子是Baden 等人（2015 年）和Maia Chagas 等人（2017 年）開發(fā)的labware.net，它允許 3D 打印極其便宜的實驗室設(shè)備，從標(biāo)準(zhǔn)可用的微量移液器和微操作器到熒光顯微鏡和光遺傳學(xué)解決方案。

最近開發(fā)了幾種開源高質(zhì)量顯微鏡。例如，Diederich 等人 (2020)開發(fā)了一個可定制的 3D 打印開源框架，可用于構(gòu)建各種顯微鏡：從具有自動對焦功能的簡單明場顯微鏡到具有樣品光學(xué)切片功能的更復(fù)雜的系統(tǒng)。然而，這些資源缺乏用于掃描大量樣本的開源系統(tǒng)。Sharkey 等人(2016)針對小動作解決了這個問題，Merces 等人 (2021)針對多孔板的穩(wěn)健成像解決了這個問題。然而，這些解決方案不提供任何細(xì)胞操作，盡管最近已經(jīng)開發(fā)了開源液體處理解決方案（例如，Wijnen 等人，2014 年；Almada 等人，2019 年；Amarante 等人，2019 年；Booeshaghi 等人，2019 年；Samokhin，2020 年；Baas 和 Saggiomo，2021 年）。

在這里，我們介紹了一個開源系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合了多孔板中的高通量顯微鏡、自動化溶液應(yīng)用、同步熒光成像和圖像分析。它成本低（不帶熒光顯微鏡的價格為 400-600 英鎊，帶熒光顯微鏡的價格為 2,500 英鎊），完全可定制，并且最多可以連續(xù)進(jìn)行 96 或 384 個實驗，如果實驗不需要高采樣率（例如每分鐘 1 幀或更高），則可以同時進(jìn)行。該平臺配備一個單通道落射熒光顯微鏡頭，可用于對動態(tài)熒光報告基因（例如 GCaMP 和合成鈣染料；Razlivanov 等人，2018 年）和/或用熒光抗體或染料標(biāo)記的樣品進(jìn)行成像。我們展示了我們的系統(tǒng)如何在嚴(yán)格控制和可重復(fù)的實驗條件下大規(guī)模快速生成細(xì)胞生物數(shù)據(jù)。

結(jié)果
典型的細(xì)胞生物學(xué)實驗范例通常涉及用生物活性化合物（例如生長因子、鈣動員激動劑和細(xì)胞毒性劑）處理細(xì)胞，并使用熒光報告基因監(jiān)測細(xì)胞行為或固定細(xì)胞以便隨后進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記或基因表達(dá)分析。為了使此類實驗自動化，我們開發(fā)了一個實驗平臺，該平臺允許自動對 96 孔板進(jìn)行成像并使用注射泵應(yīng)用八種溶液。我們首先介紹該平臺并展示其適用性，然后更詳細(xì)地描述硬件、軟件和系統(tǒng)性能。

自動化平臺及其適用性
完整組裝的系統(tǒng)如圖1A所示。硬件由幾個主要模塊組成：水平移動多孔板的 XY 平臺；帶有自動對焦系統(tǒng)的小型熒光顯微鏡（補(bǔ)充視頻 1）；以及將八種溶液應(yīng)用到各個孔中的灌注歧管（補(bǔ)充視頻 2）。構(gòu)建說明和所有 3D 打印文件可在https://github.com/frescolabs/FrescoM獲得（另見補(bǔ)充文本）?？梢允褂?Python 編寫的用戶界面操作硬件（圖 1B，有關(guān)詳細(xì)信息，請參閱“軟件”部分），該界面控制平臺、物鏡和歧管以及自動對焦、曝光、照明和實驗方案的整體管理。

為了展示該平臺，我們首先演示了它如何用于大規(guī)模熒光成像實驗（Nasu et al., 2021）。涉及熒光報告基因的典型實驗方案需要在應(yīng)用激動劑、生長因子或其他活性化合物之前和之后對細(xì)胞進(jìn)行一段時間的成像。為了證明開發(fā)的實驗平臺對這種實驗范式的可用性，我們使用合成的鈣濃度熒光指示劑進(jìn)行了鈣成像。細(xì)胞自動用熒光鈣染料 Fluo4-AM 標(biāo)記（圖 1C），并響應(yīng) 100 μm ATP 進(jìn)行鈣成像。然后使用 Cellpose 算法（Stringer et al., 2021 ）自動分割細(xì)胞（圖 1C ，右） ，并提取單個細(xì)胞的熒光動力學(xué)（圖 1D）。然后在其他 30 個孔中自動重復(fù)相同的實驗程序和分析（圖 1E、F和補(bǔ)充視頻 3）。這些實驗表明，開發(fā)的平臺可以實現(xiàn)熒光報告基因的穩(wěn)健和自動高通量成像。

所開發(fā)系統(tǒng)的另一個重要優(yōu)勢是它允許在大量孔中大規(guī)模生成圖像。 為了證明這種可用性，我們生成了一個 Python 協(xié)議類（補(bǔ)充協(xié)議 1，有關(guān)詳細(xì)信息，請參閱“軟件”部分），使平臺在所有 96 個孔上移動，對每個細(xì)胞進(jìn)行聚焦，并捕獲明場或熒光圖像。 此類實驗的示例如圖2A、B所示。 重要的是，該系統(tǒng)允許掃描單個孔并對同一個孔生成多張圖像（圖 2C），這對于尋找稀有細(xì)胞（例如，正在進(jìn)行有絲分裂/凋亡的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染效率低下的陽性細(xì)胞）很有用。

為了證明所開發(fā)的實驗平臺在標(biāo)記實驗中的可用性，我們使用了熒光小麥胚芽凝集素 (WGA)，該物質(zhì)可突出顯示細(xì)胞膜。用 PBS 自動清洗五排孔（共 48 個孔），然后加入含有 5 mg/ml 熒光 WGA 的溶液。室溫下放置 10 分鐘后，用 PBS 清洗 WGA，然后放入熒光顯微鏡下觀察。得到的熒光圖像如圖2D所示。自動標(biāo)記可產(chǎn)生具有明確質(zhì)膜的細(xì)胞的清晰圖??像，從而表明可以使用所開發(fā)的平臺自動執(zhí)行常規(guī)標(biāo)記程序。

最后，我們還測試了所開發(fā)的平臺是否可用于以抗 HER2 抗體（Herceptin）為一抗、以 Alexa 488 偶聯(lián)的二抗進(jìn)行免疫熒光染色。用 PBS 和 Herceptin 自動灌注含有 SKBR3 細(xì)胞（HER2 高表達(dá)）或 HeLa 細(xì)胞（HER2 低表達(dá)）的孔。室溫下孵育 40 分鐘后，用 PBS 灌注細(xì)胞，然后用二抗灌注。室溫下再孵育 30 分鐘后，用成像溶液灌注孔并進(jìn)行熒光成像（圖 2E和補(bǔ)充圖 1）。得到的圖像顯示，HER2 水平高的 SKBR3 細(xì)胞的細(xì)胞膜標(biāo)記清晰，但受體水平低的 HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞膜標(biāo)記不清晰，從而證明了自動標(biāo)記程序的穩(wěn)健性。

這些示例證明了所開發(fā)的實驗平臺在不同類型的細(xì)胞生物學(xué)實驗自動化方面的廣泛可用性。下面，我們將詳細(xì)描述該平臺并在一系列測試中展示其性能。

硬件設(shè)計
整體結(jié)構(gòu)由 MakerbeamXL 15 毫米 × 15 毫米擠壓件構(gòu)成，通過 L 形和 T 形鋁制支架或 3D 打印部件連接。我們發(fā)現(xiàn)使用鋁擠壓框架代替完全 3D 打印部件（兩種型號均可在https://github.com/frescolabs/FrescoM上找到）可以使整個系統(tǒng)更穩(wěn)定并減少振動（未顯示數(shù)據(jù)）?？蚣苡砂藗€側(cè)面擠壓件組成（四個垂直 300 毫米和三個水平 200 毫米，兩個在頂部，一個在底部，圖 3A）。側(cè)面與兩個 400 毫米擠壓件相連，用于固定驅(qū)動x軸的 MGH12 導(dǎo)軌。y軸（圖 3B）位于由四個 200 毫米擠壓件構(gòu)成的方形框架上，并通過兩個 3D 打印支架連接到x軸。兩個 MGH12 導(dǎo)軌位于框架上，可容納一個 Nema 17 電機(jī)和一個 96 孔板支架（圖 3B，y_plate_holder.stl 文件）。